技术摘要：
本发明公开了一种SARS‑CoV‑2 N/S1(RBD)重组蛋白及制备方法和应用，所述SARS‑CoV‑2 N/S1(RBD)重组蛋白是将在原核表达系统中易于表达的SARS‑CoV‑2病毒核衣壳(N)蛋白和SARS‑CoV‑2病毒表面刺突蛋白S1的表达基因片段按照原核E.coli偏好的密码子进行优化，并进行如下  全部
背景技术：
新型冠状病毒肺炎(COVID-19)与2003年爆发的严重急性呼吸综合征  (SARS)均具 有广泛的流行性、较强的传染性、较高的致病性,这2种疾病分别是由人类高致病性冠状病 毒SARS-Co  V-2与SARS-CoV感染所致。对SARS-CoV-2 的来源和进化、形态特征和基因结构、 感染和致病分子机制开展深入研究,取得了重大进展,为科学防控COVID-19提供了重要依 据。根据上述研究的基础,  文中对COVID-19病毒疫苗、抗体和抑制剂研发提出了设想,在研 究防控  COVID-19核心技术上具有一定的参考价值。对病毒性疾病预防用疫苗和治疗用药 物是重要组成部分,认识这类药物的研发难点,才有利于抗病毒药物研发。
技术实现要素：
为此，本发明提供了一种SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白及制备方法和应用，所 述SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白是将在原核表达系统中易于表达的SARS-CoV-2病毒核 衣壳(N)蛋白和SARS-CoV-2病毒表面刺突蛋白S1的表达基因片段按照原核E.coli偏好的密 码子进行优化，并进行如下改造：将表达病毒核衣壳(N)蛋白和SARS-CoV-2病毒表面刺突蛋 白S1进行串联表达。 本发明的第一方面提供了一种SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白，该重组蛋白的核 苷酸序列如SEQ  ID  NO.1所示。 所述重组蛋白由SARS-CoV-2病毒核衣壳(N)蛋白表达基因片段和  SARS-CoV-2病 毒表面刺突蛋白S1蛋白表达基因片段通过Linker融合连接；  SARS-CoV-2病毒核衣壳(N)蛋 白表达基因片段的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.2  所示，SARS-CoV-2病毒表面刺突蛋白S1蛋白 表达基因片段的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.3所示。 所述Linker由0-20个氨基酸组成，优选GS。 本发明第二方面提供了含有SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白的重组载体，其特征 在于，在含有抗卡那霉素的抗性选择基因的表达载体中包含有SEQ  ID NO.1核苷酸序列，表 达载体优选pET30a载体。 本发明第三方面提供了表达如上述重组载体的宿主菌。 所述宿主菌为具有卡那霉素抗性的表达菌株，优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。 本发明第四方面提供了含有SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白的重组载体的制备 方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)构建SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白基因片段，并对pET30a载体进行处理：用 限制性内切酶Nde  I和限制性内切酶Hind  III对pET30a载体双酶切； (2)以SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白基因片段为模板进行PCR扩增，回收PCR产 3 CN 111607003 A 说　明　书 2/6 页 物,克隆至pET30a载体中，用限制性内切酶Nde  I和限制性内切酶Hind  III双酶切后，将基 因片段从pUC57载体中切下来，再与处理后的  pET30a载体连接，制得重组载体。 本发明第五方面提供了SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白的表达方法，其特征在 于，包括如下步骤： (1)按照权利要求8所述的重组载体的制备方法制备含有SARS-CoV-2  N/S1(RBD) 重组蛋白的重组载体； (2)将含有SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白的重组载体转化至大肠杆菌  E.coli  BL21(DE3)，诱导表达SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白，表达时的诱导温度在15℃，诱导的 IPTG的浓度为0.5mM。 本发明第七方面提供了上述的重组蛋白在制备用于检测和/或预防和/或筛选治 疗SARS-CoV-2病毒感染的药物中的应用。 本发明的有益效果是：本发明所提供的SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白可制备预 防SARS-CoV-2病毒感染的基因工程疫苗，SARS-CoV-2病毒检测试剂盒,及筛选可抑制N或S 蛋白结合的抗SARS-CoV-2病毒感染的药物。 附图说明 图1显示为SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白诱导鉴定结果，图中：泳道  M为蛋白 (Protein)分子量标准(Marker)，从上到下分别为，200kDa，150  kDa，120kDa，100kDa， 85kDa，70kDa，60kDa，50kDa，40kDa，30kDa，  25kDa，20kDa，15kDa，10kDa；泳道1为空白对照； 泳道2为15℃  0.5mM IPTG  16h；泳道3为37℃  0.5mM  IPTG  3h。 图2显示为诱导表达后的SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白Ni柱纯化鉴定结果，图 中：泳道M为蛋白(Protein)分子量标准(Marker)，从上到下分别为，200kDa，150kDa， 120kDa，100kDa，85kDa，70kDa，60kDa，  50kDa，40kDa，30kDa，25kDa，20kDa，15kDa，10kDa；泳 道1为过滤后的上清液；泳道2为流出液；泳道3为洗脱缓冲液250mM咪唑洗脱液。 图3为纯化后的SARS-CoV-2  N/S1 (RBD)重组蛋白电泳结果：泳道M为蛋白 (Protein)分子量标准(Marker)，从上到下分别为，200kDa，150kDa，  120kDa，100kDa， 85kDa，70kDa，60kDa，50kDa，40kDa，30kDa，  25kDa，20kDa，15kDa，10kDa；泳道1为纯化的 SARS-CoV-2  N/S1(RBD)  重组蛋白(实施例中透析后的蛋白)。 图4为含有SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白的重组载体的分解图。 图5为SARS-CoV-2  N/S1(RBD)重组蛋白产品制备工艺流程图。 图6显示为SARS-CoV-2-N-S1蛋白和人体新冠病毒受体蛋白结合实验结果； 图7显示为SARS-CoV-2-N-S1蛋白和抗2019新型冠状病毒spike蛋白抗体结合实验 结果。