技术摘要：
本发明公开了一种抑霉唑半抗原YM‑A、人工抗原、重链抗体及其制备方法和应用。本发明首先提供了一种抑霉唑半抗原YM‑A，其结构式如式(I)所示：该抑霉唑半抗原YM‑A与待测物抑霉唑的骨架结构重叠度高，有效地提高了抑霉唑半抗原YM‑A的免疫原性；进一步利用该抑霉唑半抗  全部
背景技术：
抑霉唑又称烯菌灵，是一种内吸性杀菌剂，对果蔬中常见的青霉病、绿霉病等有很 好的防治作用，被广泛应用于采收后的各种水果和蔬菜的防腐保鲜。研究发现，人体若长期 摄入抑霉唑会引起内分泌系统功能紊乱，神经系统及肝脏也会受到影响。由于抑霉唑的滥 用，我国对抑霉唑在食品中的残留量要求越来越严格，最新国标GB  2763—2019相对于国标 GB  2763-2016新增8个品种检测。 抑霉唑的检测要求越来越苛刻，因此，需要一种快速、灵敏、高效的检测方法来实 现抑霉唑的快速检测。目前，抑霉唑的农药残留检测方法包括气相色谱-质谱法、液相色谱 质谱联用法、酶联免疫吸附检测法、以及其他定量检测方法；其中，气相色谱-质谱法、液相 色谱质谱联用法等仪器分析方法其样本前处理及测定过程繁琐，费用高、需要专业人员操 作，不适于大量样本筛查；而酶联免疫吸附检测法具有灵敏度高、特异性强、仪器设备要求 低和样本前处理相对简单等优点，是近年来常用的农残检测方法。酶联免疫吸附检测法基 于抗原、抗体之间特异性识别，实现对检测样品中目标物的定性、定量分析，其关键在于制 备出高特异性和高灵敏度的抗体，建立该方法的首要条件是设计合成有效的半抗原及完全 抗原。 目前，周映霞等公开了一种抑霉唑半抗原HIA，成功制备得到了抑霉唑人工抗原， 并通过免疫动物获得了效价为1:6400的鼠多抗，采用间接竞争ELISA法测定抗体的IC50值为 1.76μg/mL(杀菌剂抑霉唑人工抗原的合成和鉴定，2010)。虽然该抗体能够识别抑霉唑，但 是其识别灵敏度低；并且该半抗原HIA的制备是利用抑霉唑类似物的羟基取代反应，经过取 代，水解两步反应得到，制备过程复杂、步骤繁琐。因此，提供一种步骤简便、检测灵敏度高 和特异性强的抑霉唑检测方法具有重要意义。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有抑霉唑检测方法的缺陷和不足，提供一种抑 霉唑半抗原YM-A、人工抗原、重链抗体及其制备方法和应用。本发明制备出的抑霉唑半抗原 YM-A的合成方法更加简单，直接利用抑霉唑分子结构式进行修饰改造，在分子结构式上的 碳碳双键氧化成醛基之后，连入带有一段碳链的羧基，直接一步反应使其具有活性基团-羧 基。 本发明的第一个目的是提供一种抑霉唑半抗原YM-A。 本发明的第二个目的是提供所述抑霉唑半抗原YM-A的制备方法。 本发明的第三个目的是提供所述抑霉唑半抗原YM-A在制备抑霉唑人工抗原中的 3 CN 111548309 A 说　明　书 2/8 页 应用。 本发明的第四个目的是提供一种抑霉唑人工抗原。 本发明的第五个目的是提供一种检测抑霉唑的免疫原与包被原的组合。 本发明的第六个目的是提供所述抑霉唑半抗原YM-A、抑霉唑人工抗原或所述免疫 原与包被原的组合在检测抑霉唑或制备抑霉唑检测试剂盒中的应用。 本发明的第七个目的是提供一种抑霉唑重链抗体。 本发明的第八个目的是提供一种检测抑霉唑的方法。 本发明的第九个目的是提供一种抑霉唑检测试剂盒。 本发明上述目的通过以下技术方案实现： 本发明提供了一种抑霉唑半抗原YM-A，其结构式如式(I)所示： 所述抑霉唑半抗原YM-A与抑霉唑分子骨架结构重叠度高，有利于进行免疫诱导， 有效地提高了抑霉唑半抗原YM-A的免疫原性。 本发明还提供了所述抑霉唑半抗原YM-A的制备方法，其特征在于，利用高碘酸钠 与高锰酸钾将抑霉唑的烯丙基双键氧化为醛丙基后，再与羧甲基羟胺半盐酸盐进行肟化缩 合衍生反应，回流，萃取，取有机相干燥浓缩，浓缩物经硅胶柱层析纯化获得浅黄色固体，即 为所述抑霉唑半抗原YM-A。 本发明采用高碘酸钠与高锰酸钾的共同作用下对抑霉唑进行氧化反应，将抑霉唑 的烯丙基双键氧化为醛丙基。 优选地，所述氧化反应的温度为20℃～30℃。 更优选地，所述氧化反应的温度为20℃。 优选地，所述肟化缩合衍生反应的温度为58℃～62℃。 更优选地，所述肟化缩合衍生反应的温度为60℃。 优选地，所述萃取的萃取剂为乙酸乙酯和饱和NaCl。 所述抑霉唑半抗原YM-A在制备抑霉唑人工抗原中的应用，也应在本发明的保护范 围之内。 本发明还提供了一种抑霉唑人工抗原，其结构式如式(II)所示： 4 CN 111548309 A 说　明　书 3/8 页 其中，Protein为乳铁蛋白或卵清白蛋白。 所述抑霉唑半抗原YM-A与载体蛋白(Protein)偶联时，抑霉唑半抗原YM-A的特异 性结构突出于载体蛋白的表面，作为载体的一个抗原表位暴露给动物免疫系统，为得到特 异性高、质量高的纳米抗体奠定了基础。 本发明还提供了一种检测抑霉唑的免疫原与包被原的组合，所述免疫原为所述抑 霉唑半抗原YM-A与乳铁蛋白的偶联物，所述包被原为所述抑霉唑半抗原YM-A与卵清白蛋白 的偶联物。 优选地，所述抑霉唑半抗原YM-A与乳铁蛋白偶联的摩尔比为1：58～62。 更优选地，所述抑霉唑半抗原YM-A与乳铁蛋白偶联的摩尔比为1：60。 优选地，所述抑霉唑半抗原YM-A与卵清白蛋白偶联的摩尔比为1：78～82。 更优选地，所述抑霉唑半抗原YM-A与卵清白蛋白偶联的摩尔比为1：80。 所述抑霉唑半抗原YM-A、抑霉唑人工抗原或所述免疫原与包被原的组合在检测抑 霉唑或制备抑霉唑检测试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。 本发明还提供了一种抑霉唑重链抗体，其制备方法为：用所述抑霉唑半抗原YM-A 与乳铁蛋白的偶联物对羊驼进行免疫后，将羊驼血清交替使用Protein  A和Protein  G亲和 层析柱进行分离，洗脱，即得所述抑霉唑重链抗体。 本发明还提供了一种检测抑霉唑的方法，以所述抑霉唑半抗原YM-A与卵清白蛋白 的偶联物作为包被原，以所述抑霉唑重链抗体作为检测抗体，采用间接竞争ELISA法进行检 测。 本发明还提供了一种抑霉唑检测试剂盒，包含所述免疫原与包被原的组合。 本发明具有以下有益效果： 本发明首先提供了一种抑霉唑半抗原YM-A，该抑霉唑半抗原YM-A与待测物抑霉唑 的骨架结构重叠度高，有效地提高了抑霉唑半抗原YM-A的免疫原性；进一步利用该抑霉唑 半抗原YM-A与乳铁蛋白偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫羊驼，通过血清分离得到能够 特异性识别抑霉唑的驼源重链抗体； 本发明提供的抑霉唑半抗原YM-A、人工抗原以及重链抗体的制备方法简单易行， 制备得到的抑霉唑半抗原YM-A、抑霉唑完全抗原可有效地刺激被免疫动物产生灵敏度高、 特异性强的重链抗体，利用其所建立的检测抑霉唑的方法的最低检测限为12.39ng/mL，IC50 为122.18ng/mL，线性范围为29.41～507.63ng/mL，具有简便快速、特异性强、灵敏度高的特 点，在抑霉唑的快速有效检测中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。 5 CN 111548309 A 说　明　书 4/8 页 附图说明 图1是抑霉唑半抗原YM-A、乳铁蛋白LF和抑霉唑人工抗原的紫外全波长扫描结果 图。 图2是抑霉唑半抗原YM-A、卵清白蛋白OVA和抑霉唑人工抗原的紫外全波长扫描结 果图。 图3是SDS-PAGE对羊驼血清中的三个亚型的鉴定结果图。 图4是基于重链抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图。