技术摘要：
本发明公开了一种酿酒酵母SNG1基因缺失在提高香草醛抗性中的应用，其中涉及的SNG1基因缺失突变体的基因序列从左至右由酿酒酵母SNG1基因‑18～ 203bp的核苷酸片段、loxp‑KanMX4‑loxp的核苷酸片段、酿酒酵母SNG1基因 1446～ 1644bp的核苷酸片段构成，该突变体的核苷酸  全部
背景技术：
酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)是传统的乙醇生产菌株，它具有高效利用 己糖，高乙醇低pH耐受力的鲁棒性，同时，酿酒酵母作为一种模式真菌，人们对其分子遗传 操作认识较为丰富，操作工具和手段较多，因此成为发酵法生产乙醇以及高值化合物的主 要细胞工厂(Liu  et  al.，2009)。 木质纤维素是地球上储量最为丰富的可再生生物质资源。以木质纤维素为原料进 行生物乙醇或其他高值化合物的生产，已被全球科学家广泛关注。香草醛是木质纤维素水 解液中的一种主要的酚类抑制物，其浓度随着原料及预处理的方式不同而有所不同。香草 醛与木质纤维素水解液中的其他抑制物如糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸等协同作用，通过破坏 细胞膜结构，降低中心代谢相关酶的活性，断裂DNA，抑制翻译起始从而严重抑制微生物的 生长及后续发酵过程。科学家有利用生物脱毒来消除抑制物的抑制作用，但这一环节使得 生产成本大大增加。同时，香草醛具有抗菌、抗诱变、抗癌和防腐功能(Bezerra  et  al .， 2016；Kim  et  al.，2014)，被广泛用于化妆品、药品、饮料和食品添加剂，具有极高经济价 值。目前，香草醛的来源主要有两个，植物提取和人工合成。而天然的香草醛价格昂贵，每公 斤高达1200-4000美元，是合成产品价格的300倍。现有也有利用代谢工程手段实现在酿酒 酵母中构建香草醛合成途径，以葡萄糖为原料，对其进行从头合成(Furuya  et  al.，2017； Hansen  et  al.，2009)。然而香草醛的毒性作用抑制了香草醛的产量，0.9g  L-1的香草醛即 可对酿酒酵母的生长发酵产生严重抑制，延滞期由2小时延长至24小时左右，发酵周期大幅 度拉长。然而具有经济效益的香草醛产量一般应在1g  L-1以上，因此发掘提高酿酒酵母香草 醛抗性的突变体或元件或构建高香草醛抗性的酿酒酵母细胞工厂具有重要意义。检索发 现，有关酿酒酵母SNG1基因缺失在提高香草醛抗性中的应用鲜见报道。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株酿酒酵母SNG1基因缺失在 提高香草醛抗性中的应用。 本发明所述酿酒酵母SNG1基因缺失在提高香草醛抗性中的应用。 本发明所述的酿酒酵母SNG1基因缺失突变体，其特征在于：所述突变体的基因序 列从左至右由酿酒酵母SNG1基因-18～ 203bp的核苷酸片段、loxp-KanMX4-loxp的核苷酸 片段、酿酒酵母SNG1基因 1446～ 1644bp的核苷酸片段构成，该突变体的核苷酸序列如SEQ  ID  No.1所示；其中，所述酿酒酵母SNG1基因-18～ 203bp的核苷酸序列如SEQ  ID  No.2所 示，所述loxp-KanMX4-loxp的核苷酸序列如SEQ  ID  No .4所示，所述酿酒酵母SNG1基因 1446～ 1644bp的核苷酸片段如SEQ  ID  No.3所示。 3 CN 111549073 A 说　明　书 2/9 页 上述的酿酒酵母SNG1基因缺失突变体的构建方法是采用同源替换的方法。设计与 野生型SNG1基因序列两侧同源的突变体片段SEQ  ID  No.1，该突变体的核苷酸序列从左至 右分别是：与SNG1基因左端序列同源的如SEQ  ID  No.2所示的序列、如SEQ  ID  No.4所示的 筛选标记loxp-KanMX4-loxp的序列、与SNG1基因右端序列同源的如SEQ  ID  No.3所示的序 列。构建时先将SEQ  ID  No.2与loxp-KanMX4-loxp进行融合PCR，而后再与SEQ  ID  No.3进行 融合PCR，最终融合形成SEQ  ID  No.1。并将SEQ  ID  No.1所示的核苷酸转化酵母菌株，在添 加有800μgmL-1G418的平板上筛选转化子，得到由SEQ  ID  No.1替代的SNG1基因缺失突变体， 命名为sng1Δ突变体。具体构建步骤是： (1)酿酒酵母BY4741基因组的提取 将酿酒酵母BY4741菌株过夜培养于5mL  YEPD液体培养基中，收集菌体，利用珠磨 法破碎细胞提取BY4741基因组。 (2)SEQ  ID  No.2所示与SNG1基因左端序列同源的序列片段的获得 以酿酒酵母BY4741的基因组为模板进行PCR扩增。 扩增引物为上游引物F1f：GCCGTACAGAGAACAAATATGACTAAATCGG，下游引物F1r：AT TAAGGGTTGTCGACCTGCAGCGTACGAAGCTTCAGCTGACAGATGACAATGAGGACGGC，下划线为与loxp- KanMX4-loxp片段左端同源的序列，用于与loxp-KanMX4-loxp进行融合PCR。 (3)SEQ  ID  No.3所示与SNG1基因右端序列同源的序列片段的获得 以酿酒酵母BY4741的基因组为模板进行PCR扩增。扩增引物为上游引物F2f：GAAG TTATTAGGTGATATCAGATCCACTAGTGGCCTATGGGGAAGAAATTACGGTATTCTCGTGGC，下划线部分为与 loxp-KanMX4-loxp右端同源序列，用于与loxp-KanMX4-loxp融合PCR，下游引物F2r：TTAAT TTCCGGGCGGGTTGTTATTTTTATCAG。 (4)SEQ  ID  No.4所示的loxp-KanMX4-loxp片段的获得 loxp-KanMX4-loxp从质粒pUG6上扩增获得，以pUG6质粒为模板进行PCR扩增。引物 为上游引物F3f：CAGCTGAAGCTTCGTACGCTG，下游引物F3r：GCATAGGCCACTAGTGGATCTG。 (5)SEQ  ID  No.1所示酿酒酵母SNG1基因缺失突变体基因的核苷酸序列片段的获 得 以SEQ  ID  No.2、loxp-KanMX4-loxp、SEQ  ID  No.3的核苷酸序列片段为模板进行 融合PCR，通过PCR扩增获得SEQ  ID  No.1所示酿酒酵母SNG1基因缺失突变体基因。 (6)以SEQ  ID  No.1所示酿酒酵母SNG1基因缺失突变体基因转化酵母 将得到的SEQ  ID  No.1所示的核苷酸序列片段进行DNA凝胶纯化，再利用醋酸锂方 法转入酿酒酵母BY4741中，在含有800μg  mL-1G418的YEPD平板上进行筛选。挑取突变体转化 子，即初步获得酿酒酵母SNG1基因缺失突变体，命名为sng1Δ突变体。 (7)突变体的PCR验证： 从筛选平板上挑取单菌落，在含有200μg  mL-1G418的YEPD液体培养基中30℃培养 24h，200rpm。然后提取突变体基因组，以获得的基因组为模板，进行PCR验证。上游引物Fy设 计在SNG1序列内部，位于 87～ 110区，下游引物用F2r。 Fy：CGGGGTTTCGTACAGTAATCAGCG F2r：ATTAACCCTACCCATTAATTTCCGGGCGG 结果判定，阳性对照BY4741基因组能够扩增出1558bp的片段，若不能扩出片段，则 4 CN 111549073 A 说　明　书 3/9 页 证明敲除成功。因此正确的sng1Δ突变体基因组则不能扩增出相关核苷酸片段。 本发明所述酿酒酵母SNG1基因缺失突变体的基因在构建高香草醛抗性的酿酒酵 母细胞中的应用。 本发明提供了一株酿酒酵母SNG1基因缺失突变体，实验证实该突变株香草醛抗性 大幅度提高，在香草醛胁迫下的延滞期和发酵周期大幅度缩短。为构建高香草醛抗性的酿 酒酵母细胞提供了基础。 具体的，sng1Δ突变体与野生型对照菌株BY4741在含有6mmol  L-1香草醛的YEPD平 板上进行梯度生长实验。sng1Δ突变体的生长状况显著优于对照菌株。在含有6mmol  L-1香 草醛的SC培养基中进行有氧摇瓶发酵，突变体的最大比生长速率为0.225h-1，较对照菌株高 70％。酿酒酵母解毒香草醛的方式是将其还原成低毒的香草醇，因此，菌株还原香草醛的速 率越快，其香草醛的抗性就越强。sng1Δ突变体能够快速的将香草醛还原成香草醇，其香草 醛最大比还原速率为0.052g  g-1  h-1，较对照菌株提高48％。 本发明首次公开了一株酿酒酵母SNG1基因缺失突变体(sng1Δ突变体)，该突变体 在香草醛胁迫下的最大比生长速率和香草醛比还原速率显著高于对照菌株。该突变体适于 以木质纤维素水解液为原料的发酵生产工艺，因其自身的香草醛高抗性，使得发酵过程中 可以免去生物脱毒这一步骤，大大节约生产成本。同时该突变体也是香草醛或香草醇生产 的优势菌种，具有极大的工业应用前景。进一步的实验证实：在无胁迫下，野生型与本发明 所述sng1Δ突变体的生长并无差别；但在香草醛胁迫下，sng1Δ突变体的最大比生长速率 较对照菌株高出70％，香草醛比消耗速率高出52％。提示该突变株适用于香草醛/醇生产或 以木质纤维素为原料生产二代燃料乙醇或其他高值化合物的高香草醛耐受性酿酒酵母菌 株的构制。 附图说明 图1为sng1Δ突变体构建过程的PCR凝胶电泳图。 其中，M：marker；1：SEQ  ID  No.2所示的核苷酸片段；2：SEQ  ID  No.3所示的核苷酸 片段；3：loxp-KanMX4-loxp即SEQ  ID  No.4所示的核苷酸片段；4：SEQ  ID  No.1所示的核苷 酸片段；5：sng1Δ突变体基因组扩增SNG1，未扩出目的片段则证明敲除成功；6：野生型菌株 基因组SNG1扩增，作为阳性对照。 图2为sng1Δ及其对照菌株的梯度生长实验图。 图3为sng1Δ及其对照菌株在香草醛胁迫下的摇瓶发酵生长图。 图4为sng1Δ及其对照菌株代谢香草醛能力图。 图5为sng1Δ及其对照菌株在正常条件下的摇瓶发酵生长图。