技术摘要：
本发明提供靶向TRBC1 CAR‑T细胞的制备方法与应用。本发明还提供编码TRBC1 CAR的基因和包含所述基因的生物材料以及TRBC1 CAR感染T细胞前需删除TRBC1阳性T细胞从而构建TRBC1 CAR‑T的方法。T细胞包含TRBC1阳性（C1）和阴性（C2）细胞，因此TRBC1 CAR感染T细胞，不仅导入 全部
背景技术：
T细胞白血病和淋巴瘤侵袭性较强，且缺乏有效靶向治疗手段，5年生存率较低。因 此，亟需探索治疗T细胞白血病和淋巴瘤的新方法。 嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）基因修饰T 细胞（CAR-T）疗法 通过基因工程技术将识别肿瘤细胞且能激活T细胞的CAR体外导入患者外周血T细胞，赋予T 细胞识别和杀伤肿瘤细胞的能力，再将改造过的T细胞回输给患者，从而达到控制甚至清除 肿瘤的一种免疫治疗技术。虽然CAR-T疗法在B细胞白血病和淋巴瘤治疗中取得显著疗效， 然而正常T细胞、肿瘤T细胞和治疗性T细胞的相似性限制了CAR-T免疫疗法在T细胞恶性肿 瘤中的应用。 T细胞受体（T cell receptor，TCR）是T细胞特异且广泛表达的一种膜蛋白，包括 正常和恶性T细胞，因此TCR可以作为T细胞肿瘤的CAR-T识别靶点。TCR 由α和β链组成，二者 均分别包含可变区和恒定区，其中TCRβ链恒定区的编码基因为TRBC1或TRBC2，即每个T细胞 TCRβ链恒定区随机表达TRBC1或TRBC2，因此人体正常T细胞由表达TRBC1和TRBC2的T细胞亚 群组成（图1）。由于T细胞随机表达TRBC1或TRBC2，因此每类功能T细胞中表达TRBC1和TRBC2 的比例相对稳定（TRBC1:TRBC2约1:2），例如CD4阳性和CD8阳性T细胞中表达TRBC1和TRBC2 的比例相近，因此全部删失TRBC1阳性T细胞或TRBC2阳性T细胞都会保留部分功能T细胞而 不会对免疫系统造成严重破坏。然而，T细胞来源的肿瘤细胞是单克隆起源，仅表达TRBC1或 TRBC2，因此靶向识别TRBC1或TRBC2的CAR-T细胞，预期不仅可以消除T细胞来源的肿瘤细胞 而且还可以保留部分正常T细胞。因此，TRBC1和TRBC2分子是T细胞恶性肿瘤潜在的CAR-T治 疗靶点。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法与应用。 本发明的另一目的是提供编码TRBC1 CAR的基因和包含该基因的生物材料以及 TRBC1 CAR感染T细胞前需删除TRBC1阳性T细胞从而构建TRBC1 CAR-T的方法。。 本发明构思如下：JOVI-1抗体可以特异识别TRBC1，其轻链可变区和重链可变区用 于构建TRBC1 CAR慢病毒载体，并将其感染患者外周血T细胞（TRBC1 CAR-T）可以靶向识别 和杀伤TRBC1阳性肿瘤细胞，但由于外周血T细胞中存在TRBC1阳性（C1）和阴性（C2）两群T细 胞，因此TRBC1 CAR慢病毒感染外周血T细胞时，不仅会导入C2细胞（CAR-C2），而且会不可避 免地导入C1细胞（CAR-C1），研究人员发现：（1）CAR-C1细胞中的CAR与自身的TRBC1结合从而 导致TRBC1不能被其他TRBC1 CAR-T细胞识别；（2）大量CAR被自身TRBC1结合而不能识别靶 细胞的TRBC1从而导致CAR-C1细胞识别和杀伤靶细胞的能力下降；（3）CAR-C2细胞中混有 3 CN 111549044 A 说 明 书 2/6 页 TRBC1阳性T细胞会加速TRBC1 CAR-T细胞的衰竭和终末分化。 TRBC1 CAR-T细胞可以特异识别和杀伤TRBC1阳性肿瘤细胞，可作为TRBC1阳性T细 胞恶性肿瘤患者潜在有效的治疗方法，但制备TRBC1 CAR-T细胞前必须预先去除其中TRBC1 阳性T细胞。本发明为TRBC1阳性T细胞恶性肿瘤的CAR-T细胞治疗提供有力工具。 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种靶向T细胞TRBC1的CAR基因，其 核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸如SEQ ID NO:2所示。 本发明中，CAR的设计包含CD8α信号肽，anti-TRBC1轻链可变区，连接接头，anti- TRBC1重链可变区，CD8α铰链区，CD8α跨膜区，4-1BB，CD3 ζ胞内信号区和FLAG-tag，并进行 全基因合成，CAR的结构示意图见图3。将合成的基因通过EcoR I与Sal I双酶切，克隆到慢 病毒载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato中，并命名为pCDH-EF1-TRBC1 CAR。 第二方面，本发明提供含有所述CAR基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于 重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体（如慢病毒或逆转录病毒）、工程 菌或转基因细胞系。 第三方面，本发明提供一种靶向TRBC1阳性T细胞的慢病毒载体，所述慢病毒载体 携带有所述CAR基因。 所述慢病毒载体的出发载体可以是pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato。 第四方面，本发明提供靶向TRBC1阳性T细胞的慢病毒载体的制备方法，包括：将所 述CAR基因构建到载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato的XbaI和SalI酶切位点之间。 第五方面，本发明提供所述CAR基因、含有所述CAR基因的生物材料、携带有CAR基 因的慢病毒载体，或按照上述方法制备的慢病毒载体在制备靶向TRBC1的CAR-T细胞中的应 用。 第六方面，本发明提供靶向TRBC1的CAR-T细胞的制备方法，包括：将所述CAR基因 通过慢病毒载体导入TRBC2阳性T细胞中，使CAR基因整合到T细胞基因组上，从而实现目的 基因在TRBC2阳性T细胞中的表达。具体如下： 1）按照前述方法制备慢病毒载体，用携带有CAR基因的慢病毒载体转染宿主细胞（如 293ft细胞），产生慢病毒； 2）利用流式细胞仪或磁珠从外周血中分离出TRBC2阳性T细胞，并用慢病毒感染TRBC2 阳性T细胞。 TRBC2阳性T细胞的获得方法包括：向外周血T细胞中加入JOVI-1抗体，通过流式细 胞仪或磁珠去除TRBC1阳性T细胞（TRBC1 T细胞，记为C1），从而获得TRBC2阳性T细胞（TRBC2 T细胞，记为C2）。 第七方面，本发明提供按照上述方法制备的靶向TRBC1的CAR-T细胞。 第八方面，本发明提供所述CAR-T细胞的以下任一应用： i）用于治疗T细胞淋巴瘤和T细胞白血病； ii）用于制备治疗T细胞淋巴瘤和T细胞白血病的药物或组合物。 第九方面，本发明提供用于治疗T细胞淋巴瘤和T细胞白血病的药物或组合物，有 效成分为所述CAR-T细胞。 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果： 由于外周血T细胞中存在TRBC1阳性（C1）和阴性（C2）两群T细胞，因此TRBC1 CAR慢病毒 4 CN 111549044 A 说 明 书 3/6 页 感染外周血T细胞时，不仅会导入C2细胞（CAR-C2），而且会不可避免地导入C1细胞（CAR- C1），本发明首次发现：（1）CAR-C1细胞中的CAR与自身的TRBC1结合从而导致TRBC1不能被其 他TRBC1 CAR-T细胞识别；（2）大量CAR被自身TRBC1结合而不能识别靶细胞的TRBC1从而导 致CAR-C1细胞识别和杀伤靶细胞的能力下降；（3）CAR-C2细胞中混有TRBC1阳性T细胞会加 速TRBC1 CAR-T细胞的衰竭和终末分化。 本发明在CAR-T细胞制备过程中，通过预先去除TRBC1阳性T细胞，所制备的靶向 TRBC1的CAR-T细胞（即CAR-C2细胞）对T细胞淋巴瘤和T细胞白血病具有更好的治疗效果。 附图说明 图1为本发明中TRBC1与TRBC2的结构；其中，a：组成TCR分子的α链和β链及其结构； b：αβ TCR β链基因重排示意图。 图2为本发明中靶向TRBC1 CAR感染T细胞后的分类和相互关系。TRBC1阳性T细胞 （C1），TRBC1阴性T细胞（C2）, 表达靶向TRBC1 CAR的TRBC1阳性T细胞（CAR-C1）和表达靶向 TRBC1 CAR的TRBC1阴性T细胞（CAR-C2）。 图3为本发明中靶向T细胞TRBC1的CAR的结构示意图。 图4为本发明较佳实施例中T细胞分选为TRBC1阳性T细胞（左）和TRBC1阴性T（右） 细胞后TRBC1表达检测结果。 图5为本发明较佳实施例中慢病毒感染TRBC1阳性T细胞和TRBC1阴性T细胞感染效 率。 图6为本发明较佳实施例中CAR-C1和CAR-C2细胞TRBC1表达情况。 图7为本发明较佳实施例中CAR-C1 ,CAR-C2细胞与C1 ,CAR-C1 ,C2细胞共孵育后 IFN-γ分泌水平。 图8为本发明较佳实施例中CAR-C1和CAR-C2细胞与C1,CAR-C1 ,C2细胞共孵育后 CD107a表达情况。 图9为本发明较佳实施例中CAR-C1和CAR-C2细胞不同效靶比杀伤C1,CAR-C1,C2细 胞的情况。 图10为本发明较佳实施例中CAR-C2细胞与C1细胞共孵育后终末期分化情况。初始 T细胞（naïve T，CD45RA CCR7 ）；中枢记忆T细胞（TCM，CD45RA- CCR7 ）效应记忆T细胞（TEM， CD45RA- CCR7-）与效应T细胞（Effector T, CD45RA CCR7-）。 图11为本发明较佳实施例中CAR-C2细胞与C1细胞共孵育后衰竭指标表达升高。 图12为本发明较佳实施例中表达GFP和luciferase的Jurkat细胞（表达TRBC1）尾 静脉注射进NOG重度联合免疫缺陷小鼠体内后3天分别接受未进行基因修饰T细胞（MOCK）、 CAR-C1和CAR-C2细胞的回输，结果显示，尽管CAR-C1和CAR-C2细胞均能体内杀伤Jurkat细 胞，但CAR-C2体内杀伤Jurkat细胞能力显著强于CAR-C1，而且CAR-C1虽能体内杀伤Jurkat 细胞，但并未延长小鼠总体生存期。 图7-图8，图10-图12中，*、***表示不同处理组之间的差异具有统计学意义，*表示 P<0.05，***表示P<0.001。 5 CN 111549044 A 说 明 书 4/6 页
本发明提供靶向TRBC1 CAR‑T细胞的制备方法与应用。本发明还提供编码TRBC1 CAR的基因和包含所述基因的生物材料以及TRBC1 CAR感染T细胞前需删除TRBC1阳性T细胞从而构建TRBC1 CAR‑T的方法。T细胞包含TRBC1阳性（C1）和阴性（C2）细胞，因此TRBC1 CAR感染T细胞，不仅导入 全部
背景技术：
T细胞白血病和淋巴瘤侵袭性较强，且缺乏有效靶向治疗手段，5年生存率较低。因 此，亟需探索治疗T细胞白血病和淋巴瘤的新方法。 嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）基因修饰T 细胞（CAR-T）疗法 通过基因工程技术将识别肿瘤细胞且能激活T细胞的CAR体外导入患者外周血T细胞，赋予T 细胞识别和杀伤肿瘤细胞的能力，再将改造过的T细胞回输给患者，从而达到控制甚至清除 肿瘤的一种免疫治疗技术。虽然CAR-T疗法在B细胞白血病和淋巴瘤治疗中取得显著疗效， 然而正常T细胞、肿瘤T细胞和治疗性T细胞的相似性限制了CAR-T免疫疗法在T细胞恶性肿 瘤中的应用。 T细胞受体（T cell receptor，TCR）是T细胞特异且广泛表达的一种膜蛋白，包括 正常和恶性T细胞，因此TCR可以作为T细胞肿瘤的CAR-T识别靶点。TCR 由α和β链组成，二者 均分别包含可变区和恒定区，其中TCRβ链恒定区的编码基因为TRBC1或TRBC2，即每个T细胞 TCRβ链恒定区随机表达TRBC1或TRBC2，因此人体正常T细胞由表达TRBC1和TRBC2的T细胞亚 群组成（图1）。由于T细胞随机表达TRBC1或TRBC2，因此每类功能T细胞中表达TRBC1和TRBC2 的比例相对稳定（TRBC1:TRBC2约1:2），例如CD4阳性和CD8阳性T细胞中表达TRBC1和TRBC2 的比例相近，因此全部删失TRBC1阳性T细胞或TRBC2阳性T细胞都会保留部分功能T细胞而 不会对免疫系统造成严重破坏。然而，T细胞来源的肿瘤细胞是单克隆起源，仅表达TRBC1或 TRBC2，因此靶向识别TRBC1或TRBC2的CAR-T细胞，预期不仅可以消除T细胞来源的肿瘤细胞 而且还可以保留部分正常T细胞。因此，TRBC1和TRBC2分子是T细胞恶性肿瘤潜在的CAR-T治 疗靶点。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法与应用。 本发明的另一目的是提供编码TRBC1 CAR的基因和包含该基因的生物材料以及 TRBC1 CAR感染T细胞前需删除TRBC1阳性T细胞从而构建TRBC1 CAR-T的方法。。 本发明构思如下：JOVI-1抗体可以特异识别TRBC1，其轻链可变区和重链可变区用 于构建TRBC1 CAR慢病毒载体，并将其感染患者外周血T细胞（TRBC1 CAR-T）可以靶向识别 和杀伤TRBC1阳性肿瘤细胞，但由于外周血T细胞中存在TRBC1阳性（C1）和阴性（C2）两群T细 胞，因此TRBC1 CAR慢病毒感染外周血T细胞时，不仅会导入C2细胞（CAR-C2），而且会不可避 免地导入C1细胞（CAR-C1），研究人员发现：（1）CAR-C1细胞中的CAR与自身的TRBC1结合从而 导致TRBC1不能被其他TRBC1 CAR-T细胞识别；（2）大量CAR被自身TRBC1结合而不能识别靶 细胞的TRBC1从而导致CAR-C1细胞识别和杀伤靶细胞的能力下降；（3）CAR-C2细胞中混有 3 CN 111549044 A 说 明 书 2/6 页 TRBC1阳性T细胞会加速TRBC1 CAR-T细胞的衰竭和终末分化。 TRBC1 CAR-T细胞可以特异识别和杀伤TRBC1阳性肿瘤细胞，可作为TRBC1阳性T细 胞恶性肿瘤患者潜在有效的治疗方法，但制备TRBC1 CAR-T细胞前必须预先去除其中TRBC1 阳性T细胞。本发明为TRBC1阳性T细胞恶性肿瘤的CAR-T细胞治疗提供有力工具。 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种靶向T细胞TRBC1的CAR基因，其 核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸如SEQ ID NO:2所示。 本发明中，CAR的设计包含CD8α信号肽，anti-TRBC1轻链可变区，连接接头，anti- TRBC1重链可变区，CD8α铰链区，CD8α跨膜区，4-1BB，CD3 ζ胞内信号区和FLAG-tag，并进行 全基因合成，CAR的结构示意图见图3。将合成的基因通过EcoR I与Sal I双酶切，克隆到慢 病毒载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato中，并命名为pCDH-EF1-TRBC1 CAR。 第二方面，本发明提供含有所述CAR基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于 重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体（如慢病毒或逆转录病毒）、工程 菌或转基因细胞系。 第三方面，本发明提供一种靶向TRBC1阳性T细胞的慢病毒载体，所述慢病毒载体 携带有所述CAR基因。 所述慢病毒载体的出发载体可以是pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato。 第四方面，本发明提供靶向TRBC1阳性T细胞的慢病毒载体的制备方法，包括：将所 述CAR基因构建到载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato的XbaI和SalI酶切位点之间。 第五方面，本发明提供所述CAR基因、含有所述CAR基因的生物材料、携带有CAR基 因的慢病毒载体，或按照上述方法制备的慢病毒载体在制备靶向TRBC1的CAR-T细胞中的应 用。 第六方面，本发明提供靶向TRBC1的CAR-T细胞的制备方法，包括：将所述CAR基因 通过慢病毒载体导入TRBC2阳性T细胞中，使CAR基因整合到T细胞基因组上，从而实现目的 基因在TRBC2阳性T细胞中的表达。具体如下： 1）按照前述方法制备慢病毒载体，用携带有CAR基因的慢病毒载体转染宿主细胞（如 293ft细胞），产生慢病毒； 2）利用流式细胞仪或磁珠从外周血中分离出TRBC2阳性T细胞，并用慢病毒感染TRBC2 阳性T细胞。 TRBC2阳性T细胞的获得方法包括：向外周血T细胞中加入JOVI-1抗体，通过流式细 胞仪或磁珠去除TRBC1阳性T细胞（TRBC1 T细胞，记为C1），从而获得TRBC2阳性T细胞（TRBC2 T细胞，记为C2）。 第七方面，本发明提供按照上述方法制备的靶向TRBC1的CAR-T细胞。 第八方面，本发明提供所述CAR-T细胞的以下任一应用： i）用于治疗T细胞淋巴瘤和T细胞白血病； ii）用于制备治疗T细胞淋巴瘤和T细胞白血病的药物或组合物。 第九方面，本发明提供用于治疗T细胞淋巴瘤和T细胞白血病的药物或组合物，有 效成分为所述CAR-T细胞。 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果： 由于外周血T细胞中存在TRBC1阳性（C1）和阴性（C2）两群T细胞，因此TRBC1 CAR慢病毒 4 CN 111549044 A 说 明 书 3/6 页 感染外周血T细胞时，不仅会导入C2细胞（CAR-C2），而且会不可避免地导入C1细胞（CAR- C1），本发明首次发现：（1）CAR-C1细胞中的CAR与自身的TRBC1结合从而导致TRBC1不能被其 他TRBC1 CAR-T细胞识别；（2）大量CAR被自身TRBC1结合而不能识别靶细胞的TRBC1从而导 致CAR-C1细胞识别和杀伤靶细胞的能力下降；（3）CAR-C2细胞中混有TRBC1阳性T细胞会加 速TRBC1 CAR-T细胞的衰竭和终末分化。 本发明在CAR-T细胞制备过程中，通过预先去除TRBC1阳性T细胞，所制备的靶向 TRBC1的CAR-T细胞（即CAR-C2细胞）对T细胞淋巴瘤和T细胞白血病具有更好的治疗效果。 附图说明 图1为本发明中TRBC1与TRBC2的结构；其中，a：组成TCR分子的α链和β链及其结构； b：αβ TCR β链基因重排示意图。 图2为本发明中靶向TRBC1 CAR感染T细胞后的分类和相互关系。TRBC1阳性T细胞 （C1），TRBC1阴性T细胞（C2）, 表达靶向TRBC1 CAR的TRBC1阳性T细胞（CAR-C1）和表达靶向 TRBC1 CAR的TRBC1阴性T细胞（CAR-C2）。 图3为本发明中靶向T细胞TRBC1的CAR的结构示意图。 图4为本发明较佳实施例中T细胞分选为TRBC1阳性T细胞（左）和TRBC1阴性T（右） 细胞后TRBC1表达检测结果。 图5为本发明较佳实施例中慢病毒感染TRBC1阳性T细胞和TRBC1阴性T细胞感染效 率。 图6为本发明较佳实施例中CAR-C1和CAR-C2细胞TRBC1表达情况。 图7为本发明较佳实施例中CAR-C1 ,CAR-C2细胞与C1 ,CAR-C1 ,C2细胞共孵育后 IFN-γ分泌水平。 图8为本发明较佳实施例中CAR-C1和CAR-C2细胞与C1,CAR-C1 ,C2细胞共孵育后 CD107a表达情况。 图9为本发明较佳实施例中CAR-C1和CAR-C2细胞不同效靶比杀伤C1,CAR-C1,C2细 胞的情况。 图10为本发明较佳实施例中CAR-C2细胞与C1细胞共孵育后终末期分化情况。初始 T细胞（naïve T，CD45RA CCR7 ）；中枢记忆T细胞（TCM，CD45RA- CCR7 ）效应记忆T细胞（TEM， CD45RA- CCR7-）与效应T细胞（Effector T, CD45RA CCR7-）。 图11为本发明较佳实施例中CAR-C2细胞与C1细胞共孵育后衰竭指标表达升高。 图12为本发明较佳实施例中表达GFP和luciferase的Jurkat细胞（表达TRBC1）尾 静脉注射进NOG重度联合免疫缺陷小鼠体内后3天分别接受未进行基因修饰T细胞（MOCK）、 CAR-C1和CAR-C2细胞的回输，结果显示，尽管CAR-C1和CAR-C2细胞均能体内杀伤Jurkat细 胞，但CAR-C2体内杀伤Jurkat细胞能力显著强于CAR-C1，而且CAR-C1虽能体内杀伤Jurkat 细胞，但并未延长小鼠总体生存期。 图7-图8，图10-图12中，*、***表示不同处理组之间的差异具有统计学意义，*表示 P<0.05，***表示P<0.001。 5 CN 111549044 A 说 明 书 4/6 页
