技术摘要：
本发明公开了一种爬行动物来源的凝血酶，采用基因克隆方法获取多疣壁虎凝血酶原2(Prethrombin‑2)的序列；构建Prethrombin‑2真核表达重组质粒，转染293T细胞，诱导表达Prethrombin‑2重组蛋白并纯化；利用锯鳞蝰蛇毒(Ecarin)激活Prethrombin‑2重组蛋白，得到具有凝血 全部
背景技术：
凝血酶(Thrombin)是一种多功能的丝氨酸蛋白酶，由凝血因子Xa裂解其前体凝血 酶原后形成，是凝血级联反应中的关键酶。凝血酶除了发挥止血功能外，还对神经细胞产生 多种影响。由于凝血酶在止血与凝血、组织修复等方面起到极大的作用,已成为国内外研究 的焦点。 目前市售的凝血酶制品中大部分来源于人或牛血浆，考虑到使用牛源性凝血酶存 在传播疯牛病病毒的风险性，人们对重组人凝血酶进行了研究。 凝血酶原2(Prethrombin-2)是α凝血酶(α-thrombin)的前体，由凝血酶原 (Prothrombin)切除N端的271个氨基酸产生(不包括N-端43个氨基酸信号肽)。凝血酶原2断 开其Arg320-Ile321之间的肽键，形成A亚基和B亚基。B亚基由蛋白链和N-糖链组成。A、B两 亚基通过二硫键连接组成凝血酶，B亚基含有凝血酶的活性功能区，A亚基对凝血酶的活性 起稳定作用。Hiroshi等人公开了一种大规模的生产重组人基因型凝血酶的生产系统，以重 组Ecarin激活的凝血酶原-2制备高产量的凝血酶。该重组凝血酶与血浆来源的人凝血酶 (野生型)活性相似，可用于替代临床人或牛血浆中提取的酶-凝血酶。(Preparation of Recombinant α-Thrombin:High-Level Expression of Recombinant Human Prethrombin-2 and Its Activation by Recombinant Ecarin.J.Biochem.135,577–582 (2004))。 自然界中一些低等脊椎动物如两栖类和鱼类具有附肢损伤后可以快速止血并再 生相应的组织器官的特点。研究低等脊椎动物的凝血酶的特征及其功能，对开发新的具有 止血功能的药物具有一定的意义。
技术实现要素：
本发明以爬行动物壁虎作为研究对象，克隆了多疣壁虎凝血酶原(Prothrombin) 的cDNA序列，该序列开放阅读框编码621氨基酸序列(XP_015262498)。本发明对多疣壁虎、 人以及小鼠凝血酶原氨基酸序列进行同源比对分析，推测多疣壁虎Prothrombin存在三个 切割位点，分别是205-206的Thrombin切割位点(产生凝血酶中间体Prethrombin-1)、316- 317的Xa因子切割位点(产生凝血酶中间体Prethrombin-2)和364-365的Xa因子切割位点 (产生凝血酶中间体Meizthrombin)。将317-621的氨基酸序列定义为Prethrombin-2，以此 为模板，设计引物扩增相应的核苷酸序列，构建了Prethrombin-2真核表达质粒，通过转染 293T细胞，诱导表达、纯化得到重组蛋白Prethrombin-2。经Ecarin剪切激活，得到酶活力明 显高于重组人凝血酶的高效凝血酶(最高可达3.63倍，4℃，pH7.0)。 本发明技术方案如下 3 CN 111593037 A 说 明 书 2/5 页 一种凝血酶原或其片段，来源于爬行动物，具有产生凝血酶原Prethrombin-1的切 割位点、产生凝血酶原Prethrombin-2的切割位点和产生凝血酶原Meizthrombin的切割位 点中的一种、两种或三种。 优选的，所述的凝血酶原为Prethrombin-2。 优选的，本发明所述的爬行动物选自壁虎、龟、鳖、鳄鱼、蛇、蜥蜴。更优选壁虎。本 发明具体的示例中 ，研究对象为多疣壁虎凝血酶原，优选多疣壁虎凝血酶原2 (Prethrombin-2)，氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。 本发明进一步提供了一种凝血酶，采用凝血酶原激活物激活以本发明所述爬行动 物来源的凝血酶原或其片段得到。 本发明所述凝血酶原激活物可以为本领域熟知的能够激活凝血酶原成为凝血酶 的物质，例如FⅩa和/或FⅤa，FⅪa、Ca2 和磷脂形成的复合物，FⅦa、组织因子和Ca2 形成的 复合物，肿瘤坏死因子或蛇毒中的一种或几种。 进一步的，所述蛇毒选自来源于Echis carinatus的Ecarin或来源于Bothrops atrox、Bothrops neuwiedi或Bothrops erythromelas的酶类中的一种或几种。 本发明具体的示例中，使用的凝血酶原激活物为锯鳞蝰蛇毒Ecarin(Echis carinatus ecarin)。 本发明具体的示例中，采用基因克隆方法获取多疣壁虎凝血酶原2(Prethrombin- 2)核苷酸序列；构建Prethrombin-2真核表达重组质粒，转染293T细胞，诱导表达重组 Prethrombin-2蛋白并纯化；利用锯鳞蝰蛇毒(Ecarin)激活剪切重组Prethrombin-2蛋白， 得到具有凝血酶活性的壁虎凝血酶(gTM)。 本发明另一目的在于提供本发明所述凝血酶在制备止血剂、受伤组织粘合剂、治 疗假性动脉瘤药物中的应用。优选的，所述止血剂为中枢神经止血剂。 本发明优点 本发明首次对爬行动物的凝血酶原进行了研究，通过对多疣壁虎、人以及小鼠凝 血酶原氨基酸序列进行同源比对分析，推测多疣壁虎Prothrombin的切割位点，根据推测位 点设计了仅含有364-365的Xa因子切割位点的Prethrombin-2。不仅能够被Ecarin激活剪 切，剪切后的片段经过自组装，具有凝血酶活性。证明了本发明对多疣壁虎Prothrombin的 活性切割位点的预测是正确的。 研究结果显示，本发明所述的壁虎凝血酶(Gecko Thrombin,gTM)活性显著高于人 的凝血酶活性(最高可达3.63倍)，可代替人凝血酶，用于制备止血剂、受伤组织粘合剂、治 疗假性动脉瘤药物。并且，0-10μg/ml的gTM对神经元活力、神经元分化和突起生长没有毒性 影响，提示壁虎凝血酶(gTM)用于中枢神经止血是安全有效的。 附图说明 图1为多疣壁虎、人及小鼠凝血酶原氨基酸序列同源比对分析。 图2为Prothrombin不同位点剪切产生的各种剪切体。 图3为纯化的Prethrombin-2重组表达蛋白的SDS-PAGE图。 图4为采用Ecarin激活Prethrombin-2获得凝血酶Thrombin(gTM)的SDS-PAGE图。 图5为pH 7.0时，本发明所述凝血酶gTM和人重组凝血酶hTM在4℃、30℃和37℃条 4 CN 111593037 A 说 明 书 3/5 页 件下Kcat/Km值。 图6为37℃时，本发明所述凝血酶gTM和人重组凝血酶hTM在pH6.0、pH7.0和pH8.0 条件下的Kcat/Km值。 图7为本发明所述凝血酶gTM对PC12细胞的毒性测定结果。 图8为本发明所述凝血酶gTM对PC12细胞分化及神经元突起生长的影响。
本发明公开了一种爬行动物来源的凝血酶，采用基因克隆方法获取多疣壁虎凝血酶原2(Prethrombin‑2)的序列；构建Prethrombin‑2真核表达重组质粒，转染293T细胞，诱导表达Prethrombin‑2重组蛋白并纯化；利用锯鳞蝰蛇毒(Ecarin)激活Prethrombin‑2重组蛋白，得到具有凝血 全部
背景技术：
凝血酶(Thrombin)是一种多功能的丝氨酸蛋白酶，由凝血因子Xa裂解其前体凝血 酶原后形成，是凝血级联反应中的关键酶。凝血酶除了发挥止血功能外，还对神经细胞产生 多种影响。由于凝血酶在止血与凝血、组织修复等方面起到极大的作用,已成为国内外研究 的焦点。 目前市售的凝血酶制品中大部分来源于人或牛血浆，考虑到使用牛源性凝血酶存 在传播疯牛病病毒的风险性，人们对重组人凝血酶进行了研究。 凝血酶原2(Prethrombin-2)是α凝血酶(α-thrombin)的前体，由凝血酶原 (Prothrombin)切除N端的271个氨基酸产生(不包括N-端43个氨基酸信号肽)。凝血酶原2断 开其Arg320-Ile321之间的肽键，形成A亚基和B亚基。B亚基由蛋白链和N-糖链组成。A、B两 亚基通过二硫键连接组成凝血酶，B亚基含有凝血酶的活性功能区，A亚基对凝血酶的活性 起稳定作用。Hiroshi等人公开了一种大规模的生产重组人基因型凝血酶的生产系统，以重 组Ecarin激活的凝血酶原-2制备高产量的凝血酶。该重组凝血酶与血浆来源的人凝血酶 (野生型)活性相似，可用于替代临床人或牛血浆中提取的酶-凝血酶。(Preparation of Recombinant α-Thrombin:High-Level Expression of Recombinant Human Prethrombin-2 and Its Activation by Recombinant Ecarin.J.Biochem.135,577–582 (2004))。 自然界中一些低等脊椎动物如两栖类和鱼类具有附肢损伤后可以快速止血并再 生相应的组织器官的特点。研究低等脊椎动物的凝血酶的特征及其功能，对开发新的具有 止血功能的药物具有一定的意义。
技术实现要素：
本发明以爬行动物壁虎作为研究对象，克隆了多疣壁虎凝血酶原(Prothrombin) 的cDNA序列，该序列开放阅读框编码621氨基酸序列(XP_015262498)。本发明对多疣壁虎、 人以及小鼠凝血酶原氨基酸序列进行同源比对分析，推测多疣壁虎Prothrombin存在三个 切割位点，分别是205-206的Thrombin切割位点(产生凝血酶中间体Prethrombin-1)、316- 317的Xa因子切割位点(产生凝血酶中间体Prethrombin-2)和364-365的Xa因子切割位点 (产生凝血酶中间体Meizthrombin)。将317-621的氨基酸序列定义为Prethrombin-2，以此 为模板，设计引物扩增相应的核苷酸序列，构建了Prethrombin-2真核表达质粒，通过转染 293T细胞，诱导表达、纯化得到重组蛋白Prethrombin-2。经Ecarin剪切激活，得到酶活力明 显高于重组人凝血酶的高效凝血酶(最高可达3.63倍，4℃，pH7.0)。 本发明技术方案如下 3 CN 111593037 A 说 明 书 2/5 页 一种凝血酶原或其片段，来源于爬行动物，具有产生凝血酶原Prethrombin-1的切 割位点、产生凝血酶原Prethrombin-2的切割位点和产生凝血酶原Meizthrombin的切割位 点中的一种、两种或三种。 优选的，所述的凝血酶原为Prethrombin-2。 优选的，本发明所述的爬行动物选自壁虎、龟、鳖、鳄鱼、蛇、蜥蜴。更优选壁虎。本 发明具体的示例中 ，研究对象为多疣壁虎凝血酶原，优选多疣壁虎凝血酶原2 (Prethrombin-2)，氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。 本发明进一步提供了一种凝血酶，采用凝血酶原激活物激活以本发明所述爬行动 物来源的凝血酶原或其片段得到。 本发明所述凝血酶原激活物可以为本领域熟知的能够激活凝血酶原成为凝血酶 的物质，例如FⅩa和/或FⅤa，FⅪa、Ca2 和磷脂形成的复合物，FⅦa、组织因子和Ca2 形成的 复合物，肿瘤坏死因子或蛇毒中的一种或几种。 进一步的，所述蛇毒选自来源于Echis carinatus的Ecarin或来源于Bothrops atrox、Bothrops neuwiedi或Bothrops erythromelas的酶类中的一种或几种。 本发明具体的示例中，使用的凝血酶原激活物为锯鳞蝰蛇毒Ecarin(Echis carinatus ecarin)。 本发明具体的示例中，采用基因克隆方法获取多疣壁虎凝血酶原2(Prethrombin- 2)核苷酸序列；构建Prethrombin-2真核表达重组质粒，转染293T细胞，诱导表达重组 Prethrombin-2蛋白并纯化；利用锯鳞蝰蛇毒(Ecarin)激活剪切重组Prethrombin-2蛋白， 得到具有凝血酶活性的壁虎凝血酶(gTM)。 本发明另一目的在于提供本发明所述凝血酶在制备止血剂、受伤组织粘合剂、治 疗假性动脉瘤药物中的应用。优选的，所述止血剂为中枢神经止血剂。 本发明优点 本发明首次对爬行动物的凝血酶原进行了研究，通过对多疣壁虎、人以及小鼠凝 血酶原氨基酸序列进行同源比对分析，推测多疣壁虎Prothrombin的切割位点，根据推测位 点设计了仅含有364-365的Xa因子切割位点的Prethrombin-2。不仅能够被Ecarin激活剪 切，剪切后的片段经过自组装，具有凝血酶活性。证明了本发明对多疣壁虎Prothrombin的 活性切割位点的预测是正确的。 研究结果显示，本发明所述的壁虎凝血酶(Gecko Thrombin,gTM)活性显著高于人 的凝血酶活性(最高可达3.63倍)，可代替人凝血酶，用于制备止血剂、受伤组织粘合剂、治 疗假性动脉瘤药物。并且，0-10μg/ml的gTM对神经元活力、神经元分化和突起生长没有毒性 影响，提示壁虎凝血酶(gTM)用于中枢神经止血是安全有效的。 附图说明 图1为多疣壁虎、人及小鼠凝血酶原氨基酸序列同源比对分析。 图2为Prothrombin不同位点剪切产生的各种剪切体。 图3为纯化的Prethrombin-2重组表达蛋白的SDS-PAGE图。 图4为采用Ecarin激活Prethrombin-2获得凝血酶Thrombin(gTM)的SDS-PAGE图。 图5为pH 7.0时，本发明所述凝血酶gTM和人重组凝血酶hTM在4℃、30℃和37℃条 4 CN 111593037 A 说 明 书 3/5 页 件下Kcat/Km值。 图6为37℃时，本发明所述凝血酶gTM和人重组凝血酶hTM在pH6.0、pH7.0和pH8.0 条件下的Kcat/Km值。 图7为本发明所述凝血酶gTM对PC12细胞的毒性测定结果。 图8为本发明所述凝血酶gTM对PC12细胞分化及神经元突起生长的影响。
