技术摘要：
本发明公开了一种多氯联苯及其代谢物毒性差异的评价模型构建方法，涉及毒理学技术领域。本发明所述方法以受试物不同评价指标的量化检测结果和/或各个评价指标的量化检测结果总和作为评价受试物毒性差异的指标。本发明能够快速、简单高效地进行多氯联苯及其代谢物毒性差  全部
背景技术：
多氯联苯(Polychlorinated  biphenyls，简称PCBs)是一种广泛存在于自然环境 中的持久性有机污染物(POPs)，已有在水体、土壤和生物体内检出的报道。PCBs是一种工业 化学品，早前在全球处于大规模生产状态，直到1920年被禁止商业生产。PCBs对生物的神经 系统、生殖系统、内分泌系统等造成严重的破坏，其在生物体内积累或产生不同形式代谢 物，仍具有一定程度的蓄积性、氧化损伤效应以及潜在的激素干扰效应，成为环境和食品安 全领域的研究热点。多氯联苯的代谢产物主要有羟基、甲氧基、甲磺基类，其中羟基代谢物 为主要产物。 目前对于PCBs及其代谢物的检测多集中于仪器方法，但是仪器检测不能直观表示 生理毒性现象；对PCBs及其代谢物毒性的研究仅在部分植物、小鼠和蚯蚓开展，对斑马鱼胚 胎仅有发育毒性和代谢变化方面的研究报道。 现有技术中对PCBs及其代谢物进行毒理学研究和毒性预测的报道鲜有，同时缺乏 多氯联苯及其代谢物对斑马鱼胚胎不同方面的毒性的评价模型构建方法。 鉴于此，该发明拟提供一种有效可行的方法解决上述问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种多氯联苯及其代谢物毒性差异的评价模型构建方法， 基于斑马鱼胚胎对毒物反应的敏感性，建立多层次多角度的复合毒性评价模型，为PCBs及 其代谢物的毒理学研究和毒性预测提供高效、简单的新方法。 为了实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种多氯联苯及其代谢物毒性差异的评价模型构建方法，所述方法以受试物不同 评价指标的量化检测结果和/或各个评价指标的量化检测结果总和作为评价受试物毒性差 异的指标，包括以下步骤： (a)确定毒性评价指标，并针对每项毒性评价指标设立一项或多项评价项目； (b)针对每个评价项目，建立一个或多个毒性判断指标； (c)将受试物暴露于斑马鱼胚胎并测定各项毒性判断指标的数值； (d)将各毒性判断指标对应的检测结果进行量化； (e)通过不同评价指标的量化检测结果和/或各评价指标的量化检测结果总和评 价各受试物的毒性差异； 所述毒性评价指标包括致死毒性评价、亚致死毒性潜力评价、发育毒性评价和神 经毒性评价； 所述代谢物包含多氯联苯羟基代谢物、多氯联苯甲氧基代谢物中的一种或两种。 4 CN 111579764 A 说　明　书 2/12 页 在本发明的具体实施方案中，受试物是指可用于本申请的评价模型构建方法使用 的多氯联苯及其代谢物。 所述致死毒性评价的评价项目为48h  LC50、96h  LC50或120h  LC50，判断指标为x≤ 1mg/L、1mg/L＜x≤10mg/L和10mg/L＜x≤100mg/L。 所述亚致死毒性潜力评价的评价项目为48h  LC50/MNLC、96h  LC50/MNLC或120h  LC50/MNLC，判断指标为x＜10和x＞10。 所述发育毒性评价的评价项目包括以下方面的发育异常：心脏；脑部；耳；下颌； 眼；肝脏；肠道；躯干或尾或脊索；肌肉或体节；尾鳍；循环系统；体长；身体是否着色；身体是 否水肿和是否出血。 当评价项目为心脏时，判断指标为心包水肿和无心房心室；和/或，当评价项目为 脑部时，判断指标为变性、变小和不规则；和/或，当评价项目为耳时，判断指标为变小；和/ 或，当评价项目为下颌时，判断指标为缺失和畸形；和/或，当评价项目为眼时，判断指标为 变小、畸形和色素减少；和/或，当评价项目为肝脏时，判断指标为缺失、变性、变大、变小和 卵黄囊吸收延迟；和/或，当评价项目为肠道时，判断指标为内腔缺失、褶皱缺失、大小异常 和内腔颜色异常；和/或，当评价项目为躯干或尾或脊索时，判断指标为出现弯曲变形；当评 价项目为肌肉或体节时，判断指标为褶皱或纹理紊乱；和/或，当评价项目为尾鳍时，判断指 标为缺失、变小和鳍褶畸形；和/或，当评价项目为循环系统时，判断指标为血流过快、血流 过慢和循环缺失；和/或，当评价项目为体长时，判断指标为体长变短；和/或，当评价项目为 身体是否着色时，判断指标为身体着色；和/或，当评价指标为身体是否水肿时，判断指标为 身体水肿；和/或，当评价指标为是否出血时，判断指标为出血。 所述神经毒性评价的评价项目包括48h  LC10、96h  LC10或120h  LC10浓度下的运动 功能和活跃度。 48h  LC10、96h  LC10或120h  LC10浓度下的运动功能和活跃度的判断指标均为无影 响、有影响但p＞0.05、有影响且p＜0.05、有影响且p＜0.01和有影响且p＜0.001。 将各毒性判断指标对应的检测结果进行量化的方法为： 致死毒性评价判断指标在x≤1mg/L、1mg/L＜x≤10mg/L和10mg/L＜x≤100mg/L的 范围内分别对应3、2、1分； 亚致死毒性潜力评价判断指标在x＜10和x＞10的范围内分别对应1和2分； 发育神经毒性评价项目中各判断指标的发生率0、0-50％以及50％-100％分别对 应0、1和2分； 神经毒性评价的判断指标无影响、有影响但p＞0.05、有影响且p＜0.05、有影响且 p＜0.01、有影响且p＜0.001分别对应0、1、2、3和4分。 致死毒性评价中死亡的判定方法包括符合受精卵凝结、体节形成缺乏、尾部未脱 离、无心跳中的任一种。 发育毒性评价和神经毒性评价中将1/9MNLC、1/3MNLC、MNLC和LC10的浓度值作为发 育异常指标和神经行为异常指标的使用浓度；可选地，所述致死毒性评价和亚致死毒性潜 力评价中，rac-PCB95的暴露浓度设置为6、9、13、20、30和45μg/mL；4-OH-PCB95的暴露浓度 设置为0.9、1.2、1.5、2和2.6μg/mL；4-MeO-PCB95的暴露浓度设置为18、24、31、40和52μg/ mL。 5 CN 111579764 A 说　明　书 3/12 页 在本发明的具体实施方案中，斑马鱼胚胎选自AB型野生斑马鱼成鱼繁殖的胚胎。 在本发明的具体实施方案中，将PCBs及其代谢物用二甲基亚砜(DMSO)溶解并配制 为特定的暴露浓度。 在本发明的具体实施方案中，将受试物暴露于斑马鱼胚胎进行毒性测定时，致死 毒性检测如下： PCBs及其代谢物暴露浓度根据预实验设定；暴露方案设置供试品组(PCBs及其代 谢物暴露组)、正常对照组和溶剂对照组，平行重复3次。并将其置于人工气候箱中培养，按 时观察记录。 根据胚胎死亡判定条件，观察记录斑马鱼的死亡情况，根据各浓度组3次平行实验 的死亡数平均值绘制死亡剂量效应曲线，分别计算在暴露浓度处理下斑马鱼胚胎48h、96h 或120h后的MNLC、LC10、LC50和LC90。 在本发明中，MNLC是指受试物的最大非致死浓度；LC10是指受试物引起10％实验动 物死亡的浓度；LC50是指受试物的半数致死浓度；LC90是指受试物引起90％实验动物死亡的 浓度。 在本发明的具体实施方案中，将受试物暴露于斑马鱼胚胎进行毒性测定时，亚致 死毒性潜力指标如下：根据致死毒性的48h、96h或120h  MNLC和LC50结果，计算LC50与MNLC的 比值。 在本发明的具体实施方案中，将受试物暴露于斑马鱼胚胎进行发育毒性测定时， 暴露浓度：设置1/9MNLC、1/3MNLC、MNLC和LC10的浓度值为发育异常特定观察浓度，对应地， 用DMSO配制PCBs及其代谢物母液。暴露方案设置有供试品组、正常对照组和溶剂对照组。并 将其置于人工气候箱中培养，按时观察记录。暴露48h、96h或120h后，在体视显微镜下观察 记录各实验组斑马鱼发育毒性反应；统计各实验组的发育毒性发生率，并使用显微镜摄像 头和自有采集软件对典型发育毒性器官进行拍照。具体地，观察记录各实验组斑马鱼发育 毒性反应(包括心脏、脑、耳、下颌、眼、肝脏、肠道、躯干、肌肉体节、尾鳍、循环系统、体长、身 体着色、身体水肿和出血等部位异常)并拍照；统计各实验组发育毒性的发生率。 在本发明的具体实施方案中，将受试物暴露于斑马鱼胚胎进行神经毒性测定时， 暴露浓度：设置1/9MNLC、1/3MNLC、MNLC和LC10的浓度值为发育异常特定观察浓度，对应地， 用DMSO配制PCBs及其代谢物母液。暴露方案设置有供试品组、正常对照组和溶剂对照组。并 将其置于人工气候箱中培养，按时观察记录。暴露48h、96h或120h后，每个实验组随机选取 10尾仔鱼待行为系统检测。 利用行为分析系统测定斑马鱼的运动总距离，评价PCBs及其代谢物对斑马鱼运动 功能的影响，对斑马鱼运动功能的抑制作用/增加作用计算公式如下： 运动功能抑制作用(％)＝(1-D(供试品组)/D(溶剂对照组))×100％； 运动功能抑制作用(％)＝(D(供试品组)/D(溶剂对照组)-1)×100％。 利用行为分析仪分别观察记录各实验组斑马鱼在60min内3个明暗周期(即：黑暗 10min、光照10min交替3个周期)的活跃度，评价PCBs及其代谢物对斑马鱼活力的影响。 与现有技术相比，本发明的有益效果为： 本发明提供的方法以模式生物毒性检测技术为基础，综合急性毒性指标(致死毒 性指标、亚致死毒性潜力指标)、发育异常指标和神经行为异常指标，成功构建斑马鱼胚胎 6 CN 111579764 A 说　明　书 4/12 页 对PCBs及其代谢物的毒性评价模型构建方法，为PCBs及其代谢物的毒性预测和比较提供了 新途径。具有高效、简单、成本低、形象直观等特点。本申请的评价模型构建方法可以扩展应 用到水环境安全、农产品及食品安全等生物毒性评价与预警工作中。 附图说明 为了更清楚地说明本发明