技术摘要：
本发明公开一种模块化双特异性磁性纳米复合物与应用。所述纳米复合物核心部分是链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒水溶液，另外一部分是两种或两种以上以不同比例复配的生物素修饰的功能化配体的冻干粉，两部分使用时按照所需比例进行复配并分散于葡萄糖或氯化钠注射液中。 全部
背景技术：
现今，对恶性肿瘤的传统治疗方法主要有手术切除、放疗、化疗以及放疗和化疗相 结合的方式。虽然这些传统疗法或其组合形式具有一定的治疗效果，但无法根治肿瘤疾病。 与传统肿瘤治疗方式不同，肿瘤免疫疗法旨在开发肿瘤特异性抗体的治疗，建立和提高免 疫细胞效应机制，实现对恶性肿瘤的免疫治疗效果。随着纳米技术的进步，大量的纳米材料 被设计并作为纳米载体系统用来靶向肿瘤并传递免疫相关的治疗成分，引起并改善特异性 抗肿瘤免疫反应并降低全身毒性。在基于纳米材料的免疫治疗中，有效的肿瘤靶向能力非 常重要，因为它可以增强治疗效果。纳米载体可通过被动(称为增强的渗透和保留效应，EPR 效应)和/或主动机制靶向肿瘤部位。一方面，通过纳米载体将治疗成分直接递送至肿瘤部 位，直接诱导免疫原性细胞死亡实现免疫治疗。另一方面，在肿瘤免疫微环境中，纳米载体 还可以通过靶向免疫细胞或器官来改变免疫抑制途径，提高免疫治疗效果。 多种材料被设计为纳米载体应用于免疫治疗中，特别是一些无机纳米颗粒常被作 为理想的载体材料。在这些无机纳米材料中，获得FDA临床批准的磁性四氧化三铁(Fe3O4)纳 米颗粒常作为生物安全性载体应用于免疫治疗中。这是由于铁元素在人体中的含量丰富， 并且在多种生物过程中始终发挥着重要作用。同时，Fe3O4纳米颗粒也具有相关的免疫杀伤 作用，例如，Fe3O4纳米颗粒可通过Fenton反应诱导肿瘤相关巨噬细胞表型从M2表型极化为 M1表型，产生的活性氧(ROS)和激活的巨噬细胞联合促进了肿瘤细胞的凋亡。另外，也有研 究报道了OVA修饰的Fe3O4纳米颗粒用于肿瘤免疫治疗，其中，低剂量的Fe3O4纳米颗粒就可 作为激活剂促进免疫治疗的效果。在众多研究中，Fe3O4纳米颗粒最常见的作用是在免疫治 疗中被用作纳米载体，将治疗成分传递给肿瘤。 双特异性抗体是通过基因工程将两个单链抗体的Fab端通过短链(Fc端)连接而成 的抗体，是一种可以与两种特异性抗原结合的人工抗体。双特异性抗体最常见的形式是同 时结合两种抗原，一种抗原是肿瘤表面特异性表达的，具有驱使抗体主动靶向肿瘤的功能； 另一种抗原是T细胞上的CD3，能实现对T细胞的活化。在多例临床试验中，双特异性抗体已 被证实在增强肿瘤治疗方面具有突出的效果，在调节抗癌活性方面非常有效。例如，博纳吐 单抗(blinatumomab)，作为一种抗CD3和CD19的双特异性抗体，临床试验证明，这种抗体在 剂量较低情况下(0.015mg/m2/天或0.6ng/mL血清)能有效缓解B细胞淋巴瘤患者的疾病进 展。卡妥索单抗，作为可有效靶向CD3和上皮细胞粘附分子(EpCAM)的双特异性抗体，能有效 缓解胃癌和卵巢癌患者的恶性腹水，减缓恶性肿瘤的生长速度。虽然这些双特异性抗体均 表现出很好的免疫杀伤效果，但在临床应用中也存在一定的问题，例如在抗体制备工艺复 杂、批量生产时一致性难于控制，血液半衰期较短，因此很难有效地传递并靶向到肿瘤部 位。同时，由于抗体本身结合价数低，亲和力难于调控，功能相对单一等问题，因此亟需发展 3 CN 111569085 A 说 明 书 2/5 页 新型的可控性更强的靶向抗体免疫治疗策略。 磁性纳米颗粒作为纳米载体不仅自身具有一些免疫效应，还具有负载化疗药物、 磁靶向、磁分离、磁共振成像、磁感应热疗等功能，同时表面易于化学修饰而引入各种功能 基团，从而化学偶联各种功能性生物分子，如抗体、适配体、多肽、小分子配体等。磁性纳米 颗粒的尺寸从5nm到200nm可调，因此为生物分子偶联提供了较大的可调的表面积，种类上 可以偶联不同的抗体等生物分子，数量上可以偶联几个、几十个甚至成千上万个抗体等分 子，从而可构建出多特异性、多价结合并可调可控的纳米颗粒-抗体复合物，因此表现出比 双特异性抗体更丰富的可设计性与多功能性。
技术实现要素：
技术问题：本发明的目的是针对双特异性或多特异性抗体免疫治疗需求，以磁性 纳米颗粒作为载体，设计一种模块化易于组合的双特异性磁性纳米复合物，用于实现影像 学指导下的靶向直接杀伤肿瘤细胞与诱导免疫治疗。 技术方案：本发明通过以下技术方案予以实现： 本发明的一种模块化双特异性磁性纳米复合物主要由两部分组成，其核心部分是 链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒水溶液，另外一部分是两种或两种以上以不同比例复配的 生物素修饰的功能化配体的冻干粉，所述两部分使用时按照所需比例进行复配并分散于葡 萄糖或氯化钠注射液中，制成具有双特异性的肿瘤杀伤效果的磁性纳米复合物。 所述核心部分的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒为球形、立方体、哑铃型或星形 具有不同形貌的Fe3O4纳米颗粒经高分子聚合物修饰后通过化学键连接链霉亲和素，制备出 的磁性纳米颗粒在水溶液中稳定存在，其水动力尺寸在5-200nm之间。 所述的生物素修饰的功能化配体包括抗体、适配体、多肽、化学药物具有特异性的 功能化分子，其通过化学键与生物素交联，每个配体上标记上不少于一个生物素；将两种或 两种以上以不同比例复配的生物素修饰的功能化配体分散于缓冲溶液中，加入冻干保护剂 与赋形剂，制备成冻干粉。 构成纳米复合物中核心部分的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒与生物素修饰的 功能化配体的连接通过亲和素和生物素的特异性结合，并且这些生物素修饰的配体作为不 同模块，通过简单的替换和组合修饰在磁性纳米颗粒表面，构建出具有不同功能的纳米复 合物。 所述纳米复合物包含两种或两种以上不同功能化的配体作为不同模块，修饰在纳 米复合物表面；其中，不同的配体在纳米颗粒表面分布的数量是随机的，且各配体间不存在 相互作用效果。 所述纳米复合物中的功能化配体需包含一种或一种以上具有招募和诱导免疫细 胞杀伤肿瘤细胞的分子，经修饰后的纳米复合物能增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。 所述纳米复合物中的功能化配体需包含一种或一种以上具有靶向肿瘤细胞并可 诱导肿瘤细胞凋亡的分子，经修饰后的纳米复合物具有直接杀伤肿瘤细胞的效果。 本发明的一种模块化双特异性磁性纳米复合物的应用，该模块化双特异性磁性纳 米复合物通过磁性纳米颗粒进行磁靶向与磁共振成像，实现磁场与影像指导下的肿瘤精准 治疗。 4 CN 111569085 A 说 明 书 3/5 页 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明与现有纳米复合物的构建方式不同，该方法提出了以生物素-亲和素特异 性结合的方式构建模块化纳米复合物的方法，这种方法的优点是通过对不同模块进行简单 替换和组合，可构建出多种配体修饰的具有不同功能的纳米复合物。其中，功能化的模块包 含具有免疫激活和肿瘤细胞靶向的分子，这些分子修饰在磁性Fe3O4纳米颗表面构建出的纳 米复合物一方面能主动靶向肿瘤细胞诱导细胞凋亡，另一方面也能激活免疫细胞，提高免 疫细胞的杀伤效果。这种模块化复合物可根据治疗需求灵活进行组合，制备简单方便，易于 控制和批量制备。同时，基于磁性纳米颗粒自身的免疫效应、负载化疗药物、磁靶向、磁分 离、磁共振成像、磁感应热疗等功能，还可以实现影像学指导下的多机制协同治疗。 附图说明 图1是模块化双特异性磁性纳米复合物的构成结构示意图。 图2a至图2d是不同表面修饰的Fe3O4(核尺寸为5纳米)纳米颗粒的透射电镜图。其 中，图2a为高温热解法制备的油胺(OAm)修饰的Fe3O4纳米颗粒(OAm@Fe3O4)；图2b为配体交 换法制备的水溶性聚乙二醇(PEG)修饰的Fe3O4纳米颗粒(PEG@Fe3O4)，图2c为链霉亲和素 (SA)偶联后的Fe3O4纳米颗粒(SA@Fe3O4)；图2d为CD20单抗和CD3 单抗修饰的模块化双特异性磁性纳米复合物(CD20&CD3@Fe3O4)。 图3a至图3d是不同表面修饰的水溶性Fe3O4(核尺寸为5纳米)的表征数据图。其中， 图3a为PEG@Fe3O4，SA@Fe3O4，CD20&CD3@Fe3O4的水动力尺寸；图3b为PEG@Fe3O4，SA@Fe3O4， CD20&CD3@Fe3O4的饱和磁化强度；图3c为PEG@Fe3O4和SA@Fe3O4的红外光谱；图3d为PEG@ Fe3O4，SA@Fe3O4，CD20&CD3@Fe3O4的弛豫率。 图4a至图4f为体外细胞实验数据图。其中图4a至图4c分别是不同浓度的SA@Fe3O4 和CD20@Fe3O4与Raji细胞共孵育24小时，48小时和72小时后，Raji细胞的细胞活性图；图4d 至图4f分别是在效靶比分别为5:1，10:1和20:1的条件下，加入不同浓度的CD20&CD3@Fe3O4 纳米复合物24小时后，靶细胞的细胞活性图(其中效应细胞为T细胞，靶细胞为Raji细胞和 K562细胞)。 图5a至图5e为Raji细胞构建的淋巴瘤小鼠的体内实验数据图。其中，图5a为荷瘤 小鼠注射CD20@Fe3O4纳米复合物后不同时间点的T1增强的磁共振成像图(纳米复合物的注 射方式为尾静脉注射，注射剂量为5毫克[Fe]/Kg)；图5b为小鼠肿瘤部位的信噪比变化图； 图5c至图5e为经不同治疗组治疗后，各组荷瘤小鼠的肿瘤生长情况，体重变化和生存曲线 (治疗组分为四组，分别是PBS治疗组，T细胞治疗组，CD20&CD3@Fe3O4纳米复合物和T细胞与 CD20&CD3@Fe3O4纳米复合物联合治疗组。其中，T细胞为单次给药，给药剂量为每只小鼠注射 1×107个细胞；纳米复合物和PBS为多次给药，纳米复合物的注射剂量为5毫克[Fe]/Kg，总 计给药4次，间隔5天给药一次。所有治疗均在小鼠进行皮下移植瘤10天后开始)。
本发明公开一种模块化双特异性磁性纳米复合物与应用。所述纳米复合物核心部分是链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒水溶液，另外一部分是两种或两种以上以不同比例复配的生物素修饰的功能化配体的冻干粉，两部分使用时按照所需比例进行复配并分散于葡萄糖或氯化钠注射液中。 全部
背景技术：
现今，对恶性肿瘤的传统治疗方法主要有手术切除、放疗、化疗以及放疗和化疗相 结合的方式。虽然这些传统疗法或其组合形式具有一定的治疗效果，但无法根治肿瘤疾病。 与传统肿瘤治疗方式不同，肿瘤免疫疗法旨在开发肿瘤特异性抗体的治疗，建立和提高免 疫细胞效应机制，实现对恶性肿瘤的免疫治疗效果。随着纳米技术的进步，大量的纳米材料 被设计并作为纳米载体系统用来靶向肿瘤并传递免疫相关的治疗成分，引起并改善特异性 抗肿瘤免疫反应并降低全身毒性。在基于纳米材料的免疫治疗中，有效的肿瘤靶向能力非 常重要，因为它可以增强治疗效果。纳米载体可通过被动(称为增强的渗透和保留效应，EPR 效应)和/或主动机制靶向肿瘤部位。一方面，通过纳米载体将治疗成分直接递送至肿瘤部 位，直接诱导免疫原性细胞死亡实现免疫治疗。另一方面，在肿瘤免疫微环境中，纳米载体 还可以通过靶向免疫细胞或器官来改变免疫抑制途径，提高免疫治疗效果。 多种材料被设计为纳米载体应用于免疫治疗中，特别是一些无机纳米颗粒常被作 为理想的载体材料。在这些无机纳米材料中，获得FDA临床批准的磁性四氧化三铁(Fe3O4)纳 米颗粒常作为生物安全性载体应用于免疫治疗中。这是由于铁元素在人体中的含量丰富， 并且在多种生物过程中始终发挥着重要作用。同时，Fe3O4纳米颗粒也具有相关的免疫杀伤 作用，例如，Fe3O4纳米颗粒可通过Fenton反应诱导肿瘤相关巨噬细胞表型从M2表型极化为 M1表型，产生的活性氧(ROS)和激活的巨噬细胞联合促进了肿瘤细胞的凋亡。另外，也有研 究报道了OVA修饰的Fe3O4纳米颗粒用于肿瘤免疫治疗，其中，低剂量的Fe3O4纳米颗粒就可 作为激活剂促进免疫治疗的效果。在众多研究中，Fe3O4纳米颗粒最常见的作用是在免疫治 疗中被用作纳米载体，将治疗成分传递给肿瘤。 双特异性抗体是通过基因工程将两个单链抗体的Fab端通过短链(Fc端)连接而成 的抗体，是一种可以与两种特异性抗原结合的人工抗体。双特异性抗体最常见的形式是同 时结合两种抗原，一种抗原是肿瘤表面特异性表达的，具有驱使抗体主动靶向肿瘤的功能； 另一种抗原是T细胞上的CD3，能实现对T细胞的活化。在多例临床试验中，双特异性抗体已 被证实在增强肿瘤治疗方面具有突出的效果，在调节抗癌活性方面非常有效。例如，博纳吐 单抗(blinatumomab)，作为一种抗CD3和CD19的双特异性抗体，临床试验证明，这种抗体在 剂量较低情况下(0.015mg/m2/天或0.6ng/mL血清)能有效缓解B细胞淋巴瘤患者的疾病进 展。卡妥索单抗，作为可有效靶向CD3和上皮细胞粘附分子(EpCAM)的双特异性抗体，能有效 缓解胃癌和卵巢癌患者的恶性腹水，减缓恶性肿瘤的生长速度。虽然这些双特异性抗体均 表现出很好的免疫杀伤效果，但在临床应用中也存在一定的问题，例如在抗体制备工艺复 杂、批量生产时一致性难于控制，血液半衰期较短，因此很难有效地传递并靶向到肿瘤部 位。同时，由于抗体本身结合价数低，亲和力难于调控，功能相对单一等问题，因此亟需发展 3 CN 111569085 A 说 明 书 2/5 页 新型的可控性更强的靶向抗体免疫治疗策略。 磁性纳米颗粒作为纳米载体不仅自身具有一些免疫效应，还具有负载化疗药物、 磁靶向、磁分离、磁共振成像、磁感应热疗等功能，同时表面易于化学修饰而引入各种功能 基团，从而化学偶联各种功能性生物分子，如抗体、适配体、多肽、小分子配体等。磁性纳米 颗粒的尺寸从5nm到200nm可调，因此为生物分子偶联提供了较大的可调的表面积，种类上 可以偶联不同的抗体等生物分子，数量上可以偶联几个、几十个甚至成千上万个抗体等分 子，从而可构建出多特异性、多价结合并可调可控的纳米颗粒-抗体复合物，因此表现出比 双特异性抗体更丰富的可设计性与多功能性。
技术实现要素：
技术问题：本发明的目的是针对双特异性或多特异性抗体免疫治疗需求，以磁性 纳米颗粒作为载体，设计一种模块化易于组合的双特异性磁性纳米复合物，用于实现影像 学指导下的靶向直接杀伤肿瘤细胞与诱导免疫治疗。 技术方案：本发明通过以下技术方案予以实现： 本发明的一种模块化双特异性磁性纳米复合物主要由两部分组成，其核心部分是 链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒水溶液，另外一部分是两种或两种以上以不同比例复配的 生物素修饰的功能化配体的冻干粉，所述两部分使用时按照所需比例进行复配并分散于葡 萄糖或氯化钠注射液中，制成具有双特异性的肿瘤杀伤效果的磁性纳米复合物。 所述核心部分的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒为球形、立方体、哑铃型或星形 具有不同形貌的Fe3O4纳米颗粒经高分子聚合物修饰后通过化学键连接链霉亲和素，制备出 的磁性纳米颗粒在水溶液中稳定存在，其水动力尺寸在5-200nm之间。 所述的生物素修饰的功能化配体包括抗体、适配体、多肽、化学药物具有特异性的 功能化分子，其通过化学键与生物素交联，每个配体上标记上不少于一个生物素；将两种或 两种以上以不同比例复配的生物素修饰的功能化配体分散于缓冲溶液中，加入冻干保护剂 与赋形剂，制备成冻干粉。 构成纳米复合物中核心部分的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒与生物素修饰的 功能化配体的连接通过亲和素和生物素的特异性结合，并且这些生物素修饰的配体作为不 同模块，通过简单的替换和组合修饰在磁性纳米颗粒表面，构建出具有不同功能的纳米复 合物。 所述纳米复合物包含两种或两种以上不同功能化的配体作为不同模块，修饰在纳 米复合物表面；其中，不同的配体在纳米颗粒表面分布的数量是随机的，且各配体间不存在 相互作用效果。 所述纳米复合物中的功能化配体需包含一种或一种以上具有招募和诱导免疫细 胞杀伤肿瘤细胞的分子，经修饰后的纳米复合物能增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。 所述纳米复合物中的功能化配体需包含一种或一种以上具有靶向肿瘤细胞并可 诱导肿瘤细胞凋亡的分子，经修饰后的纳米复合物具有直接杀伤肿瘤细胞的效果。 本发明的一种模块化双特异性磁性纳米复合物的应用，该模块化双特异性磁性纳 米复合物通过磁性纳米颗粒进行磁靶向与磁共振成像，实现磁场与影像指导下的肿瘤精准 治疗。 4 CN 111569085 A 说 明 书 3/5 页 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明与现有纳米复合物的构建方式不同，该方法提出了以生物素-亲和素特异 性结合的方式构建模块化纳米复合物的方法，这种方法的优点是通过对不同模块进行简单 替换和组合，可构建出多种配体修饰的具有不同功能的纳米复合物。其中，功能化的模块包 含具有免疫激活和肿瘤细胞靶向的分子，这些分子修饰在磁性Fe3O4纳米颗表面构建出的纳 米复合物一方面能主动靶向肿瘤细胞诱导细胞凋亡，另一方面也能激活免疫细胞，提高免 疫细胞的杀伤效果。这种模块化复合物可根据治疗需求灵活进行组合，制备简单方便，易于 控制和批量制备。同时，基于磁性纳米颗粒自身的免疫效应、负载化疗药物、磁靶向、磁分 离、磁共振成像、磁感应热疗等功能，还可以实现影像学指导下的多机制协同治疗。 附图说明 图1是模块化双特异性磁性纳米复合物的构成结构示意图。 图2a至图2d是不同表面修饰的Fe3O4(核尺寸为5纳米)纳米颗粒的透射电镜图。其 中，图2a为高温热解法制备的油胺(OAm)修饰的Fe3O4纳米颗粒(OAm@Fe3O4)；图2b为配体交 换法制备的水溶性聚乙二醇(PEG)修饰的Fe3O4纳米颗粒(PEG@Fe3O4)，图2c为链霉亲和素 (SA)偶联后的Fe3O4纳米颗粒(SA@Fe3O4)；图2d为CD20单抗和CD3 单抗修饰的模块化双特异性磁性纳米复合物(CD20&CD3@Fe3O4)。 图3a至图3d是不同表面修饰的水溶性Fe3O4(核尺寸为5纳米)的表征数据图。其中， 图3a为PEG@Fe3O4，SA@Fe3O4，CD20&CD3@Fe3O4的水动力尺寸；图3b为PEG@Fe3O4，SA@Fe3O4， CD20&CD3@Fe3O4的饱和磁化强度；图3c为PEG@Fe3O4和SA@Fe3O4的红外光谱；图3d为PEG@ Fe3O4，SA@Fe3O4，CD20&CD3@Fe3O4的弛豫率。 图4a至图4f为体外细胞实验数据图。其中图4a至图4c分别是不同浓度的SA@Fe3O4 和CD20@Fe3O4与Raji细胞共孵育24小时，48小时和72小时后，Raji细胞的细胞活性图；图4d 至图4f分别是在效靶比分别为5:1，10:1和20:1的条件下，加入不同浓度的CD20&CD3@Fe3O4 纳米复合物24小时后，靶细胞的细胞活性图(其中效应细胞为T细胞，靶细胞为Raji细胞和 K562细胞)。 图5a至图5e为Raji细胞构建的淋巴瘤小鼠的体内实验数据图。其中，图5a为荷瘤 小鼠注射CD20@Fe3O4纳米复合物后不同时间点的T1增强的磁共振成像图(纳米复合物的注 射方式为尾静脉注射，注射剂量为5毫克[Fe]/Kg)；图5b为小鼠肿瘤部位的信噪比变化图； 图5c至图5e为经不同治疗组治疗后，各组荷瘤小鼠的肿瘤生长情况，体重变化和生存曲线 (治疗组分为四组，分别是PBS治疗组，T细胞治疗组，CD20&CD3@Fe3O4纳米复合物和T细胞与 CD20&CD3@Fe3O4纳米复合物联合治疗组。其中，T细胞为单次给药，给药剂量为每只小鼠注射 1×107个细胞；纳米复合物和PBS为多次给药，纳米复合物的注射剂量为5毫克[Fe]/Kg，总 计给药4次，间隔5天给药一次。所有治疗均在小鼠进行皮下移植瘤10天后开始)。
