技术摘要：
本发明公开了一种恒温无核酸扩增的MTHFR基因C677T位点分型方法所用的反应探针，由野生型探针和突变型探针组成；野生型探针为WT1、uni，突变型探针为MT1、uni。本发明还同时公开了包含上述反应探针的检测体系，以及利用该检测体系进行的恒温无核酸扩增的MTHFR基因C677T  全部
背景技术：
同一种药物或者营养物质对一部分人非常有效或者吸收效果好，对另一部分人效 果却不明显，是因为他们基因组中存在的差异。这种差异很多表现为人类基因组上单个碱 基上的变异，也就是单核苷酸的多态性(SNP)。单核苷酸的多态性，全称Single  Nucleotide  Polymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异形成的遗传标记，其数量很多，多态性 丰富。因此，SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可 能与SNP有关。 叶酸是一种水溶性B族维生素，因最初从菠菜叶中提取得到，故称为叶酸。叶酸是 合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可 缺少的营养素。近年来大量研究已经证实，叶酸缺乏是导致出生缺陷的主要原因。叶酸的临 床功能除了预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产和胎儿宫内发 育迟缓、早产以及新生儿低出生体重等发病率。叶酸摄入不足或者由于基因导致叶酸代谢 能力差，都可能导致高同型半胱氨酸血症，引发新生儿出生缺陷等不良后果，叶酸过量摄入 也可能导致胎儿生长缓慢、孕妇恶性贫血，增加结肠腺瘤和乳腺癌风险等副作用。因此，在 进行叶酸补充前，提前进行基因检测，评估个体的叶酸代谢利用能力，个性化指导叶酸摄入 量非常必要。参与叶酸代谢最重要的基因是亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)。研究发 现，MTHFR的活性与C677T基因位点最为有关。当基因位点发生突变时就会导致MTHFR活性下 降，进而引起叶酸利用能力不足，宝宝出生缺陷风险增加。C677T，就是一个典型的SNP位点。 目前检测SNP的方法有很多，sanger测序法、焦磷酸测序、taqman探针、armsPCR、 HRM高分辨融解曲线等等，但几乎所有方法都需要用到核酸扩增技术，且大部分需要有一个 变温的过程，包括DNA双链的变性、退火、延伸，这样就导致需要一个能变温的仪器模块，比 如PCR仪，价格较贵，使得该技术推广受限。同时PCR扩增还带来一个问题，PCR产物会形成气 融胶，弥散在空气中，这些产物可以做为第二次PCR的模板进行扩增，极易引起污染，对检测 结果造成假阳性。因此在国内，PCR技术主要应用于临床，规定必须建设专门的核酸扩增室， 至少包括试剂准备间，扩增间，检测间，并对每个房间设置气压差以避免交叉污染。这对于 项目的开展是一笔巨大的投入，极大限制了分子生物学在临床上的应用。
技术实现要素：
本发明要解决的问题是提供一种利用恒温且无核酸扩增的技术来检测SNP位点， 对其进行分型。 本发明的方法克服了现有技术的限制，以叶酸代谢MTHFR的C677T位点为例，利用 4 CN 111549121 A 说　明　书 2/13 页 本发明的基因检测技术，将该位点区分为纯合野生CC型、杂合CT型、纯合TT突变型，从而指 导孕妇对叶酸的摄入量。 为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是： 对MTHFR基因的C677T位点，在dbSNP数据库记录号为rs1801133，通过NCBI数据库 获得该位点两侧的序列(作为参考序列)，括号内带下划线的部分为野生型与突变型的不同 碱基，如下： tttgaggctgacctgaagcacttgaaggagaaggtgtctgcgggag[C/T]cgatttcatcatcacgc agcttttctttgaggctgacacattcttc 分别针对该位点的野生型或突变型，设计两对探针，使两条野生型探针的序列正 好与野生型CC序列匹配；另两条突变型探针的序列与突变型TT序列匹配；两对探针的差别 为上游探针3’端的一个碱基不同，两对探针的下游探针是相同的，记为uni探针。 野生型探针(WT1、uni)为： WT1:5’aaaagctgcgtgatgatgaaatcgG3’，在探针5’端标记荧光基团(例如为FAM荧 光基团)； uni:5’ctcccgcagacaccttctccttcaa  3’，在探针5’端进行磷酸化修饰，3’端标记 淬灭基团(例如为BHQ-1淬灭基团)； 与参考序列的野生型可形成如下双链结构： 3‘aacttcctcttccacagacgccctc5’3’Ggctaaagtagtagtgcgtcgaaaa  5’ 5‘ttgaaggagaaggtgtctgcgggag[C]cgatttcatcatcacgcagctttt 设计突变型探针(MT1、uni)为： MT1:5’aaaagctgcgtgatgatgaaatcgA3’，在5’端标记荧光基团(例如为FAM荧光基 团) uni:5’ctcccgcagacaccttctccttcaa  3’，在探针5’端进行磷酸化修饰，3’端标记 淬灭基团(例如为BHQ-1淬灭基团)； 与参考序列的突变型可形成如下双链结构： 3‘aacttcctcttccacagacgccctc5’3’Agctaaagtagtagtgcgtcgaaaa  5’ 5‘ttgaaggagaaggtgtctgcgggag[T]cgatttcatcatcacgcagctttt 具体序列如表1所示： 表1、序列表 每条探针的长度在20-30bp之间。 所有序列，由中国takara公司(中国地区称为大连宝生物有限公司)负责合成，返 回后稀释成10pmole/ul深度，分装后避光保存。 本发明中所述发光基团为FAM、TET、J0E、HEX、TAMRA、R0X中的任意一种，所述淬灭 5 CN 111549121 A 说　明　书 3/13 页 基团为Dabcyl、BHQ-1、BHQ-2中的任意一种。 本发明还同时提供了包含上述反应探针的检测体系：包括作为模板的待测DNA、5X 反应缓冲液、WT1探针、MT1探针、Uni探针、解旋酶、单链结合蛋白SSB、T4DNA连接酶、纯水。 作为本发明的检测体系的改进： 在本发明中涉及的解旋酶制剂可以包括单种解旋酶或多种解旋酶。制剂中的解旋 酶可以选自3'至5'端解旋酶类型或5'至3'端解旋酶类型。更特别的，解旋酶制剂可以包括 来自超家族1-4的解旋酶或AAA 解旋酶。解旋酶可以是六聚体解旋酶(hexamerichelicase) 或单体解方定酶(monomeric  helicase)或二聚体解方定酶(dimeric  heiicase)。更特别 地，解旋酶可以是UvrD解旋酶或其同源物(homolog)，例如热稳定的解旋酶或其同源物。 即，解旋酶为以下任一：大肠杆菌UvrD解旋酶、Tte-UvrD解旋酶、T7Gp4解旋酶、 RecBCD解旋酶、DnaB解旋酶、MCM解旋酶、Rep解旋酶、RecQ解旋酶、PcrA解旋酶、SV40大T抗原 解旋酶(SV40large  T  antigen  helicase)、疱疹病毒解旋酶、酵母Sgsl解旋酶、DEAH—ATP 依赖性解旋酶(DEAH—ATP-dependent  helicases)、乳头瘤病毒解旋酶El蛋白 (Papilliomavirus  hdicase  El  protein)及其同源物。 在本发明中使用的解旋酶为热稳定性解旋酶Tte-UvrD解旋酶，可购买自美国NEB 公司。 单链结合蛋白(SSB)为以下任一：ET  SSB(极高热稳定单链结合蛋白)、T4基因 32SSB、大肠杆菌SSB、T7基因2.5SSB、噬菌体phi  29  SSB和它们的衍生物，以及辅助蛋白(如 MutL)。本发明中使用的单链结合蛋白ET  SSB超热稳定单链结合蛋白购买自美国NEB公司。 T4DNA连接酶为Hi-T4TM耐热DNA连接酶，购买自美国NEB公司。 5X反应缓冲液为：10X  T4DNA连接酶反应缓冲液500μL、1000mM(NH4)2SO4  50μL、 5000mM  KCl  50μL、10％(体积％) 20  50μL、pH  6.0～9.0的Tris-HCl缓冲液补足至 1000μL。 上述10X  T4DNA连接酶反应缓冲液(50mM  Tris-HCl，10mM  MgCl2，10mM  DTT，1mM  ATP，pH  7.5)，购买自美国NEB公司。 本发明的方法是在解旋酶制剂的作用下，将双链DNA解链，所设序列特异型探针与 目的片段特异型结合，并通过DNA连接酶连接后，发生探针荧光基团淬灭，从而通过检测荧 光量的变化情况，判定SNP位点的具体基因型。其中DNA连接酶，能够催化磷酸二酯键的形 成，使杂交到同一靶DNA链上的两条寡核苷酸链的5’-磷酸末端和3’-羟基末端通过磷酸二 酯键连接，因此这个连接反应只有当两条寡核苷酸链与靶DNA完全配对并且二者之间没有 空隙的条件下才可发生，而当探针3’末端碱基与靶DNA不能完全匹配，则连接酶不能起作 用，不能发生连接反应。 本发明的具体使用方法如下： 在本发明在实施方案中，提供了用于确定在解旋酶依赖下的目的基因连接反应体 系中所使用反应体系和反应条件是否适于高效连接目标核酸片段的方法，包括制备包含有 解旋酶、缓冲液以及可选配的单链结合蛋白和/或辅助蛋白，以及DNA连接酶的反应体系。其 中反应体系为：Tris-HCl缓冲液提供大约pH  6.0-9.0的pH范围，KC1的浓度为50mM，(NH4) 2SO4的浓度为10mM，MgCl2的浓度为1mM，DTT浓度为1mM，ATP为浓度0.1mM， 20的浓度 为0.1％将不同浓度或拷贝数的探针序列DNA连接酶加入到解旋酶制剂中；在约45℃和65℃ 6 CN 111549121 A 说　明　书 4/13 页 之间的温度温育混合物和分析检测结果，确定是否发生了选择性的线性连接。 血液DNA提取试剂盒：Qiagen  DNeasy  Blood  Tissue  Kit试剂盒(德国凯杰公司， 货号69506)。 本发明试剂中所使用的化学试剂，如(NH4)2SO4、MgSO4、10％ 20等购自上海 生工生物有限公司。 检测方法具体如下： 1.自身采外周血2ml，利用血液DNA提取试剂盒提取基因组DNA，95℃变性4分钟后， 作为模板，放冰上备用； 2.配置5  X反应缓冲液 3.在冰上制备以下反应体系： 3.1野生型反应体系 模板(50ng/μL) 10μL 5X上述缓冲液 5μL WT1探针(1pM) 1μL Uni探针(1pM) 3μL 解旋酶 1U 单链结合蛋白SSB 1U Hi-T4TM耐热DNA连接酶 1U 总体积，用无核酶的纯水补足到 25μL 3.2突变型反应体系 模板(50ng/μL) 10μL 5X上述缓冲液 5μL MT1探针(1pM) 1μL Uni探针(1pM) 3μL 解旋酶 1U 单链结合蛋白SSB 1U Hi-T4TM耐热DNA连接酶 1U 总体积，用无核酶的纯水补足到 25μL 说明：野生型反应体系、突变型反应体系中，除了上游探针不同外，其余完全相同。 野生型检测体系/突变型检测体系分别于定量PCR仪上，进行如下程序： 50℃恒温，起始时检测荧光，而后设置每隔1分钟，检测一次荧光，荧光通道与探针 7 CN 111549121 A 说　明　书 5/13 页 的荧光基团相匹配(例如FAM)；45分钟后停止检测； 检测方法为包含以下步骤： 步骤1、首先判定反应结果，任选以下一种方法： 方法一、 当10分钟时的荧光相对值＜95％，反应结果属于阳性； 当10分钟时的荧光相对值≥95％，不予判断，需要等到45分钟后按照方法二再进 行判断； 方法二、 当45分钟时的荧光相对值＜75％，反应结果属于阳性； 当45分钟时的荧光相对值＞90％，反应结果属于阴性； 75％≤当45分钟时的荧光相对值≤90％，反应结果属于临界值； 方法一、方法二中，荧光相对值＝检测体系在该时间对应的荧光值/检测体系起始 荧光值(即，时间为0时对应的荧光值)； 步骤2、最终结果判读： 当野生型检测体系的反应结果为阳性、且突变型检测体系的反应结果为阴性时， 判定该该待测DNA属于纯合野生型； 当野生型检测体系的反应结果为阳性、且突变型检测体系的反应结果为阳性时， 判定该该待测DNA属于杂合型； 当野生型检测体系的反应结果为阴性、且突变型检测体系的反应结果为阳性时， 判定该该待测DNA属于纯合突变型； 当野生型检测体系、突变型检测体系中只要有一个的反应结果属于临界区间时， 者当野生型检测体系和突变型检测体系的反应结果均为阴性时，判定需要对该待测DNA重 新进行检测。 需要重新进行检测的原因例如为：模板量太少，DNA模板质量不行，或超出检测灵 敏度，建议加大模板量重做。 本发明中，以事先采用具有cFDA批文的人类MTHFR(C677T)基因多态性检测试剂盒 (PCR-熔解曲线法)(国械注准20183400118)，检测结果为纯合野生型的作为本实验的野生 型样本质控品，检测结果为杂合型、纯合突变型作为本实验的突变型样本质控品，分别采用 该发明中的野生型反应液和突变型反应液同时对上述质控品进行检测。 以各反应管中初始荧光信号值为1，进行归一化处理；然后按照表2进行判定。 在各时间点上，信号值在阴性质控与杂合阳性之间的，为判断不清楚，模板量太 少，DNA模板质量不行，或超出检测灵敏度，建议加大模板量重做。 表2 野生型反应结果 突变型反应结果 最终结果判读 阳性 阴性 纯合野生型 阳性 阳性 杂合型 阴性 阳性 纯合突变型 临界值 无论阴性或阳性 需加大模板量重做实验 无论阴性或阳性 临界值 需加大模板量重做实验 8 CN 111549121 A 说　明　书 6/13 页 临界值 临界值 需加大模板量重做实验 以野生型反应体系为例，其结果如图2。 本发明的技术原理如下图1所示： 1、在解旋酶作用下双链DNA解链，在解旋酶及SSB等结合蛋白的共同作用下，双链 解旋为单链； 2、在解旋完成的DNA单链中，两条探针与目的序列匹配，在DNA连接酶作用下两条 探针连接成为一条，使荧光淬灭：当带有FAM荧光的探针和带有BHQ1淬灭基团的探针分开 时，能够发出荧光，并通过qPCR仪检测到。而当杂交时，若带FAM荧光的探针、BHQ1淬灭基团 的探针与模板能够匹配，则可以通过DNA连接酶的作用，催化3’OH和5’磷酸基团形成磷酸二 酯键，从而使两条探针连接成为一条，使荧光淬灭，并与模板形成一个互补的双链。若两条 探针与模板不能匹配，则两条探针就不会连接成一条探针，荧光也不会淬灭。 3、在循环过程中，为保证加入的带有荧光基团和淬灭基团的荧光探针连接效率， 将带有淬灭基团探针量，设置为带有荧光基团探针3～5倍(摩尔比)，即uni探针是WT1探针 的3～5倍，同时uni探针是MT1探针的3～5倍，保证此类单连接探针优选结合在模板上，发生 连接反应。在反复发生的连接过程中通过qPCR仪检测不同时间的荧光信号值，经过不断的 循环，在解旋酶和连接酶活性充足的情况下，荧光将不断的衰减，荧光信号呈线性下降。 本发明具有如下性能优势： 1、本发明采用了恒温的反应体系，可以最大程度降低对高精密仪器的依赖，众所 周知，PCR仪由于升降温模块，精密度要求较高，不同的PCR仪容易由于升降温速率不同，导 致结果不稳定，或者不同实验室结果不一致，同时qPCR成本也较高。本发明的恒温体系有助 于降低分子生物学检测的门槛，将变温模块去掉，降低仪器成本。 2、本发明采用了独创的闭管检测，以及无扩增反应体系，几乎可以避免所有因核 酸扩增带来的气溶胶污染。从而使实验条件的要求也大大降低，不再需要临床核酸扩增实 验室，使得该检测能在普通的理化实验室完成。这大大增加了该技术的应用范围。 3、本发明的结果检测，可以采用实时荧光检测，也可以采用终点荧光检测法，这使 得对检测设备的要求可以进一步降低。 综上所述，本发明可以在恒温，无扩增的条件下对MTHFR基因C677T位点进行分型。 即，理论上，采用本发明的方法，保温杯 试纸条就能进行基因检测。 附图说明 下面结合附图对本发明的