技术摘要：
本发明公开了一种广谱性有机磷农药适配体及方法和应用，该适配体的核苷酸序列为如SEQ.ID NO 7所示的序列。本发明的适配体，能够识别多种有机磷农药，且亲和力均比现有适配体有所提高，而且S4‑29仅具有29个碱基，序列较短，合成成本低，更有利于传感器的构建，能够应用  全部
背景技术：
有机磷农药是我国目前使用范围最广、用量最大的农药，可分为剧毒、高毒、中毒、 低毒四类，人体接触少量的剧毒及高毒类即可中毒，且低毒类的大量进入体内亦可发生危 害。因此，为保证人体的健康，建立高效、方便快捷的有机磷农药残留的检测方法具有重要 意义。 适配体是二十世纪九十年代发展起来的新型检测元件，由DNA或RNA组成，通过折 叠形成特定的三维结构，与靶标分子进行空间构象识别，具有高亲和力和高特异性。适配体 在有机磷农药的检测中，有机磷农药是化学小分子，适配体结合有机磷农药，多余的核酸序 列可能形成复杂的高级构象，反而不利于适配体识别；过长的核酸序列也不利于检测方法 的构建，还增加合成成本。因此，更好的亲和力适配体的选择和核酸探针的合理设计是提高 适配体的选择性尤为重要，也有利于适配体传感器的构建。 目前，张存政等人公开了基于分子信标的有机磷农药适配体活性位点分析及改 造，通过逐步切除两条适配体二级结构中的茎环结构，通过比较分析其重要的茎环结构，截 断其余茎环结构，把两条序列的重要结构重新组合形成一条新的适配体，序列长度由55个 碱基截短至35个碱基，得到适配体S24，序列为5’-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAG CT-3’，其二级结构为： 上述适配体的检测原理主要是：在无靶标(农药)存在时，分子信标(分子信标是一 个简单的发夹结构，与适配体部分互补配对，两端分别携带荧光基团和荧光淬灭基团)与适 配体互补配对，荧光强度较高；有靶标存在时，靶标与分子信标竞争结合适配体，荧光强度 4 CN 111593054 A 说　明　书 2/6 页 降低，与靶标浓度呈负相关。该检测方法的检测限为0.005mg/L，检测范围0.005-10.0mg/L。 该方法实验繁琐、效率低，且截短后的适配体对部分农药的亲和力降低，而且检测方法灵敏 度低，检测范围较窄。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种广谱性有机磷农药适配体及方法和应用，解决了现有适 配体检测灵敏度低的问题，能够提高与农药之间的亲和力，灵敏度高，且检测范围宽。 为了达到上述目的，本发明提供了一种广谱性有机磷农药适配体，该适配体的核 苷酸序列为如SEQ.ID  NO  7所示的序列。 优选地，核苷酸序列为如SEQ.ID  NO  7所示的适配体，其二级结构为： 本发明的另一目的是提供一种所述的适配体在检测有机磷农药方面的应用。 优选地，所述有机磷农药的结构式为： 其中，A和A’各自独立地选自短链的烷氧基、烷硫基、芳氧基和胺基中任意一种；R 选自脂肪烃基或芳香烃基；X和Y各自独立地选自O或S。 优选地，所述有机磷农药包含：水胺硫磷、丙溴磷、甲拌磷和氧化乐果中任意一种 或两种以上。 本发明的另一目的是提供一种检测有机磷农药的方法，该方法包含： 将核壳型纳米磁珠Fe3O4@PPy加入5’端标记有6-羧基荧光素(FAM)的所述的适配体 中，磁分离去除游离适配体，得到适配体与Fe3O4@PPy的复合物； 5 CN 111593054 A 说　明　书 3/6 页 将所述复合物于结合缓冲液中，加入所述的有机磷农药，在室温下振荡孵育；待孵 育结束后，磁分离，保留上清液，测定荧光强度。 本发明的方法，适配体通过π-π堆积作用吸附至Fe3O4@PPy表面，FAM荧光被淬灭，通 过磁分离过程去除游离适配体，此时荧光强度最低。加入靶标有机磷农药之后，Fe3O4@PPy表 面的适配体优先与有机磷农药结合，并被触发打开结构，形成有机磷农药-适配体复合物， 抑制PPy吸附适配体，这种作用使Fe3O4@PPy释放5’端标记有6-羧基荧光素的适配体，荧光强 度得到恢复。 优选地，该方法还包含：将所述复合物于结合缓冲液中，不加有机磷农药，在室温 下振荡孵育；待孵育结束后，磁分离，保留上清液，测定荧光强度；将未加有机磷农药测定的 荧光强度记为F1，将加有机磷农药测定的荧光强度记为F2；通过计算相对荧光强度[(F2- F1)/F1]来评估输出信号。 优选地，所述复合物，经核壳型纳米磁珠Fe3O4@PPy与适配体室温孵育，荧光淬灭， 再磁分离后获得。 优选地，所述荧光强度由酶标仪测定，激发波长为485nm，发射波长为535nm。 优选地，该方法对有机磷农药的检测浓度范围为0.001～100nM。 本发明的广谱性有机磷农药适配体及方法和应用，解决了现有适配体检测灵敏度 低的问题，具有以下优点： 本发明的适配体，能够识别多种有机磷农药，且亲和力均比现有适配体有所提高， 而且S4-29仅具有29个碱基，序列较短，合成成本低，更有利于传感器的构建，能够应用于有 机磷农药检测，如在食品(砂糖桔)中有机磷农药检测。 本发明的检测方法，能够检测的农药浓度范围为0.001～100nM，而且甲拌磷、氧化 乐果、丙溴磷的浓度与信号值呈良好的线性关系，检测限分别为0.0016nM、0 .0013nM、 0.00125nM。 附图说明 图1为本发明实施例1及对比例1的适配体和现有适配体S4-54的二级结构图。 图2为本发明实施例1及对比例1的适配体和现有适配体S4-54和S24的结合曲线 图。 图3为本发明的适配体S4-29和现有适配体S4-54的特异性实验结果。 图4为本发明的氧化乐果、甲胺磷或丙溴磷的荧光强度的变化结果。 注：图2中，A为各适配体对水胺硫磷的结合曲线图，B为各适配体对丙溴磷的结合 曲线图，C为各适配体对甲拌磷的结合曲线图，D为各适配体对氧化乐果的结合曲线图。