技术摘要：
本发明属于生物技术领域，涉及一种无铜催化原子转移自由基聚合方法，包括以下步骤：(1)在培养基中培养微生物菌株，得到菌液；(2)将步骤(1)得到的菌液进行离心，取菌泥接种到PBS缓冲液中，接种过程向PBS缓冲液中充氮气；(3)称取单体加入步骤(2)接种菌泥后的PBS缓冲液中  全部
背景技术：
近年来，细胞表面修饰技术受到越来越多学者的关注。而现有的细胞表面修饰技 术主要有无机材料与聚合物修饰。无机材料修饰主要有在细胞表面修饰铁硫化物、纳米金 属等，虽然易于合成，但是可控性差；而聚合物修饰大多是在聚合物表面涂覆海藻酸钠、壳 聚糖等，虽然可以保护细胞，但是功能性差。 王锦山博士提出的原子转移自由基聚合(ATRP)技术，实现了真正意义上的活性可 控自由基聚合。这是一种以简单的有机卤化物为引发剂、过渡金属配合物为卤原子载体，通 过氧化还原反应，在活性种与休眠种之间建立可逆的动态平衡，从而实现对聚合反应的控 制。ATRP反应的单体种类广泛，反应条件温和且具有很好的可控性，可制备大分子引发剂， 分子设计能力强，如能够合成嵌段、梳状、星型、梯度和超支化等形态的聚合物。 表面引发的原子转移自由基聚合(SI-ATRP)技术以其温和的反应条件被广泛应用 于制备具有不同功能的平面基材和某些功能性生物材料，如自组装多肽、蛋白质、病毒等， 以增强其物理化学性能。其中，表面引发的电子转移活化再生催化剂原子转移自由基聚合 (SI-ARGET  ATRP)技术以其低浓度的自由基和对聚合物结构的精确控制，使得该技术在活 细胞上得到应用。据报道，Choi等人在酵母细胞表面合成了保护性聚多巴胺(PD)层，以作为 自由基清除剂并保护ATRP中的酵母细胞。但是，铜离子对于这些基于活细胞的ATRP反应都 是至关重要的。而铜离子作为重金属，其存在的毒性和可能的污染更多地阻碍了它们的实 际应用。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提出一种活细胞无铜催化原子转移自由基聚合方法 和由该方法制备得到的微生物-聚合物杂合体，微生物表面广泛分布的外膜蛋白如细胞色 素C，含有大量血红素，本发明以细胞色素C作为金属催化蛋白酶(ATRPase)，在细胞表面进 行原位ARGET-ATRP反应，血红素或其衍生物充当了ATRPase的催化中心，进而可以催化包括 ARGET-ATRP在内的无铜添加的可控自由基聚合反应，降低了铜离子对细胞的毒性和可能存 在的污染。本发明在常温水溶液中合成微生物/聚合物杂合体系，方法简单，反应条件温和， 环境友好。另外，微生物可以规模化培养，因此，可以大批量制备。 本发明通过以下技术方案实现：一种无铜催化原子转移自由基聚合方法，包括以 下步骤： (1)微生物培养：在培养基中培养微生物菌株，得到菌液； (2)添加细胞催化剂：将步骤(1)得到的菌液进行离心，取菌泥接种到PBS缓冲液 中，接种过程向PBS缓冲液中充氮气； (3)添加单体：称取单体加入步骤(2)接种菌泥后的PBS缓冲液中，持续向PBS缓冲 3 CN 111549074 A 说　明　书 2/7 页 液中充氮气； (4)添加还原剂：取配制好的抗坏血酸溶液加入步骤(3)含有单体并接种菌泥后的 PBS缓冲液中，持续向PBS缓冲液中充氮气； (5)添加引发剂：向步骤(4)的PBS缓冲液中加入引发剂，密封，并置于摇床中培养， 培养后经离心、洗涤、重悬，获得微生物-聚合物杂合体系。 上述方案中，步骤(1)中的微生物与培养基的接种体积比为：0.05:100～0.8:100。 上述方案中，步骤(2)所述PBS缓冲液为Na2HPO4·12H2O  1.44g/L、KH2PO4  0.24g/L、 NaCl  8g/L和KCl  0.2g/L，pH＝7.4。 上述方案中，步骤(2)中所述PBS缓冲液体积为3-10mL。 上述方案中，步骤(2)所述离心的条件为3000-7000rpm，时间5min。 上述方案中，步骤(2)所述PBS缓冲液中接种的微生物终浓度达到OD600值为0.5～5 时停止接种。 上述方案中，步骤(3)所述单体为甲基丙烯酸钠或甲基丙烯酸2-(二甲氨基)乙酯； 所述PBS缓冲液中加入的单体终浓度为0.1M。 上述方案中，步骤(4)所述无氧水由超纯水煮沸后通氮气30min后制得，所述抗坏 血酸溶液的浓度为1M；所述PBS缓冲液中抗坏血酸溶液的终浓度为10mM。 上述方案中，步骤(5)所述引发剂为α-溴异丁酰溴； 所述反应缓冲液中引发剂终浓度为1mM； 所述培养的条件为：时间30min-5h，转速150-250rpm，温度10～40℃；所述离心的 转速为2000～8000rpm，时间为2～10min； 所述洗涤是用新鲜的PBS缓冲液进行清洗。 上述方案中，步骤(1)所述微生物为真菌、革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，分别以 酵母、大肠杆菌或芽孢杆菌为例。 当所述微生物为真菌时，以酵母为例： 1)配制YPD培养基和PBS缓冲液，然后将酵母细胞接种到YPD培养基中进行培养，获 得菌液； 2)取适量PBS缓冲液置于反应瓶中，并开始向缓冲液中充氮气； 3)将步骤1)得到的菌液进行离心，取菌泥加入到步骤1)制备的PBS缓冲液中，当缓 冲液中酵母细胞的终浓度达到一定OD600值时，停止接种菌泥； 4)称取一定质量的单体甲基丙烯酸钠(SMA)，加入步骤2)接种菌泥后的反应缓冲 液中； 5)用无氧水配制抗坏血酸溶液，取抗坏血酸溶液加入步骤3)含有单体并接种菌泥 后的反应缓冲液中，继续向缓冲液中充氮气； 6)向步骤4)的反应缓冲液中加入引发剂α-溴异丁酰溴(BIBB)，立即盖上反应瓶 盖，置于摇床中培养，培养后经离心、洗涤、重悬，获得酵母细胞-聚甲基丙烯酸钠杂合体系。 7)将酵母细胞换成不同微生物菌株，重复上述步骤2)、3)、4)、5)、6)，获得不同菌 株-聚甲基丙烯酸钠杂合体系。 优选的，步骤1)所述YPD液体培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖 20g/L，pH＝7。 4 CN 111549074 A 说　明　书 3/7 页 优选的，步骤1)所述酵母细胞的培养条件是温度30℃、震荡转数180rpm、培养时间 是12～20h。 优选的，步骤1)所述酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)，购自中 国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC编号2.3965。 优选的，步骤1)所述YPD培养基中的接种量与YPD培养基的体积比为0.05:100～ 0.8:100。 优选的，步骤2)所述向缓冲液中充氮气时间40min-1h，贯穿整个实验过程。 优选的，步骤3)所述反应缓冲液中酵母细胞终浓度达到OD600值为0.5～5。 优选的，步骤7)所述不同菌株为革兰氏阴性菌，以大肠埃希氏菌(Escherichia  coli)为例，CGMCC编号1.12883；革兰氏阳性菌，以枯草芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)为 例，CGMCC编号1.3358，均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。 优选的，步骤7)所述菌株均用LB培养基培养，LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母 提取物5g/L、氯化钠5g/L、pH＝7；LB培养基中的接种量与LB培养基的体积比为0.05:100～ 0.8:100；菌株的培养条件是温度37℃、震荡转数180rpm、培养时间是10-15h。 一种根据所述无铜催化原子转移自由基聚合方法制备的微生物-聚合物杂合体 系。 与现有技术相比，本发明的有益效果： (1)本发明提出的活细胞无铜催化原子转移自由基聚合(c-ATRP)方法，首次提出 采用含天然铁血红素的蛋白催化ARGET-ATRP，即细胞中的金属蛋白代替铜离子作为催化剂 进行ATRP反应，降低了铜离子对细胞的毒性和可能存在的污染。 (2)本发明提出的活细胞无铜催化原子转移自由基聚合(c-ATRP)方法既可用于真 菌(以酵母细胞为例)，也可以用于革兰氏阴性菌(以模式菌株大肠杆菌为例)和革兰氏阳性 菌(以模式菌株枯草芽孢杆菌为例)，具有普适性。 (3)本发明提出的活细胞无铜催化原子转移自由基聚合(c-ATRP)方法，可以在常 温水溶液中进行，方法更简单，反应条件更温和，对环境更加友好，并且可大批量制备微生 物-聚合物杂合体系。 (4)本发明提出的活细胞无铜催化原子转移自由基聚合(c-ATRP)方法具有高细胞 相容性，表明c-ATRP在生物技术的广阔领域中的应用前景。 附图说明 图1为制备的酵母细胞-聚甲基丙烯酸钠杂合体系的单体转化曲线。 图2为实施例1制备的酵母细胞-聚甲基丙烯酸钠杂合体系的SEM电镜图。 图3为实施例1、6制备的酵母细胞-聚甲基丙烯酸钠杂合体系的Zeta电位。 图4为实施例1、7、8对酵母细胞活性影响对比图。 图5为实施例1制备的酵母细胞-聚甲基丙烯酸钠杂合体系的流式细胞仪结果。 图6中实施例1、9、10制备的微生物-聚合物杂合体系的单体转化率对比图。