技术摘要：
本发明公开了一种检测MYD88基因L265P突变的引物和探针及高灵敏度检测方法，检测过程包括如下步骤：步骤一，提取人全血样本中的DNA；步骤二，荧光PCR检测，得到荧光结果图：用MYD88 L265P F和MYD88 L265P WR引物及MYD88 L265P Probe探针特异性扩增野生DNA；用MYD88 L265  全部
背景技术：
髓系分化因子88(myeloid  differentiation  primary  response  88,MYD88)基因 位于3号染色体短臂,共有5个外显子。MYD88  L265P基因突变是MYD88基因位于第5个外显子 38182640位点的T→C点突变,其导致了MYD88蛋白TIR区域的265位氨基酸-亮氨酸被脯氨酸 所取代，是MYD88基因最主要的突变。 MYD88基因突变见于约90％LPL/WM(淋巴浆细胞淋巴瘤/Waldenstrom巨球蛋白血 症)。而SMZL(脾边缘区淋巴瘤)、CLL伴浆细胞分化及IgM分泌型MM中则罕见甚至无MYD88基 因突变。故该基因突变可用于LPL/WM的鉴别诊断。 另外MYD88基因突变也见于IgM-secreting  MGUS(IgM型意义未明的单克隆免疫球 蛋白血症)，突变率为60％-80％。同时研究表明，MYD88基因突变与预后存在相关性。与野生 型相比，MYD88基因突变在LPL/WM患者中预示着疾病进展缓慢且生存期更长；而在IgM分泌 型MGUS患者中则是危险因子，具有更高的血清IgM水平，更重的骨髓侵犯；发展为WM的风险 增高。 目前对于MYD88  L265P突变检测常见有以下方法： 1.PCR-Sanger测序法 目前对基因突变检测最常见方法，多项研究均采用该方法检测MYD88突变。但是大 部分LPL/WM患者，初诊时骨髓和外周血异常细胞比例低于30％，而常规Sanger测序法的灵 敏度是15％-20％，常规的PCR-sanger法可能会出现假阴性测序结果。 2.AS-PCR电泳法 目前在类似单碱基突变的基因检测中也常用该检测方法。相较于传统的PCR- Sanger测序法，AS-PCR电泳法具有灵敏度更高、检测周期更短的优势。但是AS-PCR电泳法， 采用电泳检测，在部分突变含量低的样本中，容易造成结果误判。 市场需要一种快速、高灵敏、高特异检测MYD88  L256P突变的检测方法，本发明解 决这样的问题。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测MYD88基因L265P突变的 引物和探针及高灵敏度检测方法，本发明利用AS-PCR荧光法，再配合利用筛选得到的引物 及探针，提高了检测的特异性和灵敏度。 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案： 一种检测MYD88基因L265P突变的引物和探针， 4 CN 111593126 A 说　明　书 2/8 页 引物包括： MYD88  L265P  F:GGATGGCTGTTGTTAACC； MYD88  L265P  WR1:GCCTTGTACTTGATGGGGATgA； MYD88  L265P  MR1:CCTTGTACTTGATGGGGATgG； 探针包括： MYD88  L265P  Probe:5’FAM-CCCTTGGCTTGCAGGTGCCCATCAGA-3’TAMRAM。 一种检测MYD88基因L265P突变的高灵敏度检测方法，包括如下步骤： 步骤一，提取人全血样本中的DNA； 步骤二，荧光PCR检测，得到荧光结果图： 用MYD88  L265P  F和MYD88  L265P  WR1引物及MYD88  L265P  Probe探针特异性扩增 野生DNA； 用MYD88  L265P  F和MYD88  L265P  MR1引物及MYD88  L265P  Probe探针特异性扩增 突变DNA； 引物包括： MYD88  L265P  F:GGATGGCTGTTGTTAACC； MYD88  L265P  WR1:GCCTTGTACTTGATGGGGATgA； MYD88  L265P  MR1:CCTTGTACTTGATGGGGATgG； 探针包括： MYD88  L265P  Probe:5’FAM-CCCTTGGCTTGCAGGTGCCCATCAGA-3’TAMRAM； 步骤三，根据MYD88野生扩增体系和突变扩增体系扩增曲线图，判断结果是否突 变； 结果判读依据以下原则： 注：MM代表突变扩增体系结果，MW代表野生扩增体系结果。 前述的一种检测MYD88基因L265P突变的高灵敏度检测方法， 配置的PCR扩增体系包括：野生型体系，突变型体系； 野生型体系包括： 引物MYD88  L265P  F和MYD88  L265P  WR1各0.4-1ul， MYD88  L265P  Probe探针(10μM)0.2-0.6ul， PCR  Master  Mix  12.5ul， 去离子水4.9-10.5ul， 5 CN 111593126 A 说　明　书 3/8 页 DNA模版1-5ul； 突变型体系包括： 引物MYD88  L265P  F和MYD88  L265P  MR1各0.4-1ul  ul， MYD88  L265P  Probe探针(10μM)0.2-0.6ul， Realtime  PCR  Master  Mix  12.5ul， 去离子水4.9-10.5ul， DNA模版1-5ul。 前述的一种检测MYD88基因L265P突变的高灵敏度检测方法， 野生型体系包括： 引物MYD88  L265P  F和MYD88  L265P  WR1各0.8ul， MYD88  L265P  Probe探针(10μM)0.4ul， PCR  Master  Mix  12.5ul， 去离子水8.5ul， DNA模版2ul； 前述的一种检测MYD88基因L265P突变的高灵敏度检测方法， 突变型体系包括： 引物MYD88  L265P  F和MYD88  L265P  MR1各0.8ul， MYD88  L265P  Probe探针(10μM)0.4ul， Realtime  PCR  Master  Mix  12.5ul， 去离子水8.5ul， DNA模版2ul。 前述的一种检测MYD88基因L265P突变的高灵敏度检测方法， 步骤二，荧光PCR检测，得到荧光结果图： PCR扩增的条件为: 本发明的有益之处在于： 本发明利用AS-PCR荧光法，再配合利用筛选得到的引物及探针，提高了检测的特 异性，检测10例健康人血样，未扩增出阳性；提高了检测的灵敏度，经流式细胞仪检测，异常 细胞含量低至2.6％的骨髓样本，仍可检出阳性。 检测过程速度，只需要2-2.5小时即可完成检测。 附图说明 图1是使用测序方法对待检血液样本A进行MYD88  L265P位点测序结果图； 图2是使用本发明方法对待检血液样本A进行MYD88  L265P位点检测结果图； 图3是使用测序方法对待检血液样本B进行MYD88  L265P位点测序结果图； 6 CN 111593126 A 说　明　书 4/8 页 图4是使用测序方法对待检血液样本A进行MYD88  L265P位点检测结果图； 图5是使用本发明的AS-PCR荧光方法对待检血液样本A进行MYD88基因L265P突变 检测的荧光结果图； 图6是使用测序方法对待检血液样本B进行MYD88  L265P位点测序结果图； 图7是使用本发明的AS-PCR荧光方法对待检血液样本B进行MYD88基因L265P突变 检测的荧光结果图； 图8是本发明的特异性验证实验的扩增结果示意图。