技术摘要：
本发明公开了一种环境胁迫下植物中酶活性的原位可视化测定方法，包括植物预处理；酶谱成像；标曲制作；图像处理。本发明提供了一种污染物胁迫下植物中酶活性的原位可视化测定方法，弥补了现有技术中植物叶片酶谱的技术空白。同时，本发明通过提供一系列的图像处理手段  全部
背景技术：
邻苯二甲酸酯(PAEs)是一类重要的人工合成有机化合物，广泛应用于塑料增塑剂 (俗称塑化剂)，以及汽车、服装、化妆品、润滑剂和农药等行业，大量进入环境中，并具有半 挥发性和远距离迁移性，成为全球性环境污染物。PAEs具有致癌、致畸、致突变等毒性，尤以 造成人体生殖功能异常最受关注，是典型的内分泌干扰物，被人们称为“第二个全球性PCB 污染物”。目前，包括我国在内的许多国家和环保组织将其列入优先控制污染物，并采取相 应措施防止PAEs对人类健康的危害。 迄今为止，植物酶活性已被广泛用作评价重金属和有机污染物等环境胁迫的生物 指标。例如，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等几种抗氧化酶被 用来评价在胁迫条件下(包括盐度、辐照、低温、有机污染物和重金属等)活性氧(ROS)的生 成。与蔗糖磷酸合成酶(SPS)、转化酶(INV)和蔗糖合成酶(SS)一样，ROS通常用于评估环境 条件对植物碳代谢的影响。酶活性对污染物的响应不均匀，酶的选择因研究的不同而不同。 然而，以往的研究仅在生化水平上进行；很少涉及到在环境样品中，特别是在植物中。事实 上，酶活性测定已有60多年的历史，常用的方法有分光光度法、荧光法、滴定法和放射性同 位素法，而且大多数利用荧光成像方法的研究都是定性的，而关于植物中酶活性对应激条 件的反应的可视化目前还未见报道。 酶谱是通过底物转换(本质上是酶成像)来显示酶活性。利用荧光成像来测量酶活 性是一种强大的方法，因为它具有灵敏度高、图像采集相对容易、获得的环境样品中酶活性 空间异质性的大量精细尺度信息。目前关于酶谱的研究主要集中在土壤酶谱技术，可用于 作用于任何生物底物上的水解酶或氧化酶，包括蛋白质和多肽、低聚糖和多糖、脂质和糖。 然而，关于叶片酶谱的研究至今未有报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种污染物胁迫 下植物中酶活性的原位可视化测定方法。 本发明的第二个目的在于提供上述原位可视化测定方法的应用。 本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的： 一种环境胁迫下植物中酶活性的原位可视化测定方法，包括如下步骤： S1.将植物在环境胁迫下进行预处理； S2.配置酶活性荧光标记底物溶液，将聚酰胺膜浸泡在所述酶活性荧光标记底物 溶液中，待膜被底物溶液均匀饱和后取出，风干后将其与S1预处理后的植物叶片表面紧密 3 CN 111593090 A 说　明　书 2/10 页 贴合，固定，叶片两侧施加压力，于暗室中反应；反应结束后，将聚酰胺膜从叶片表面剥离， 于激发波长为355nm，发射波长为460nm的紫外灯下，对聚酰胺膜进行拍摄，获得叶片酶谱图 像； S3.配置系列浓度的标准荧光产物溶液，以未添加荧光产物的缓冲液为空白对照， 将聚酰胺膜于缓冲液中浸泡；再将上述系列浓度的标准荧光产物溶液滴加到风干的聚酰胺 膜上，使用与S2酶谱成像相同的拍摄条件进行拍摄，获得标曲图像； S4.将S3获得的标曲图像，原始图像转化为8-bit灰阶图，以σG＝0.5的高斯滤波核 进行降噪，再以灰度值为98作为全局阈值对所有降噪后的梯度浓度标准荧光灰阶图进行图 像分割并计算灰度均值，最终得到扣除背景的梯度浓度标准荧光均值，然后根据不同浓度 的标准荧光产物与其图像灰度的变化拟合出分段校正曲线： 其中 为施加于膜上的荧光底物浓度；a1，a2，b1，b2是线性回归拟合的参数； G*为分断点处的灰度值； 是经过分割的图像的平均灰度值；分段校正曲线的第一部分用 于将酶谱中的像素灰度值转化为酶活性，并将校正曲线中的灰度值赋予成比例关系的RGB 颜色，获得的RGB颜色条将用于创建查找表LUT，用于生成伪彩色叶片酶谱图；将S2获得的叶 片酶谱图像转化为8-bit灰阶图，以σG＝0.5的高斯滤波核进行降噪，记录各图像四角5×5 范围内的灰度均值，以此作为图像的背景灰度并在全图扣除得到最终的灰度图像，然后将 LUT应用于叶片图像，从而将叶片酶活性的空间分布可视化。 本发明是利用高淬灭荧光底物法来进行植物酶活的原位可视化；底物一端连接一 分子的荧光色素结合，另一端与荧光淬灭剂结合，正常情况下荧光信号无法释放。当被该底 物饱和的膜与预处理后的植物相接触后，底物被植物叶片中的酶降解，淬灭剂脱落，作用消 失，在紫外的激发光下发射出荧光，此时通过检测荧光信号强度在膜上的分布便可获得植 物酶活性在叶片上的分布情况。在上述步骤中，其中，叶片图像处理是一个重要的问题，它 会对所有后续统计分析的结果产生深远影响。但是，先前的研究缺乏有关如何重建高质量 图像从而提高其定性准确性的有用信息。本发明通过使用σG＝0.5的高斯滤波器对进行降 噪增强处理。同时为了获得荧光底物的真实荧光强度，本发明在计算标曲图像的灰度平均 值之前进行图像分割，使用了全局阈值的方法来分割背景和前景；最终通过图像去噪和分 割对图像进行处理以重建高质量图像从而提高其定性准确性的有用信息。 优选地，还包括以叶片酶谱中灰度值超过校正曲线第一部分75％的区域为热区， 通过计算叶片酶谱中热区面积的变化来研究酶活性较高区域在环境胁迫下空间分布的变 化，用于表示酶活性从叶基到叶尖的分布趋势。从而为了更好地说明沿主叶脉酶活性的空 间分布 具体地，所述植物为菜心。 具体地，所述环境胁迫为污染物胁迫。 具体地，所述污染物为邻苯二甲酸酯。 具体地，所述污染物为邻苯二甲酸二丁酯。 4 CN 111593090 A 说　明　书 3/10 页 具体地，所述酶为β-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶或木聚糖酶中的至少一种。 优选地，所述荧光标记为4-甲基伞形酮；即所述酶活性荧光标记底物为4-甲基伞 形酮-β-D-葡糖苷(MUF-G)、4-甲基伞形酮-β-D-磷酸酯(MUF-P)或4-甲基伞形酮-β-D-木糖 苷(MUF-X)中的至少一种，其浓度为80～120μM。 优选地，所述聚酰胺膜孔径为0.45μm，大小为3×5cm2。 具体地，本发明通过上述酶谱技术来量化植物叶片中DBP胁迫下的酶活性。，研究 葡萄糖苷酶、木聚糖酶和酸性磷酸酶在植物叶子的二维分布，为污染物胁迫下的植物毒性 评价和生理反应提供了新的思路。 作为一种优选地可实施方式，所述DBP胁迫下植物中葡萄糖苷酶、木聚糖酶和酸性 磷酸酶的原位可视化测定方法包括如下步骤： (1)植物种植和暴露：种植无污染的植物幼苗，例如菜心；配置一系列DBP溶液，将 幼苗置于DBP环境中暴露，进行污染物胁迫预处理； (2)酶谱成像：幼苗完成暴露后，将4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷(MUF-G)、4-甲基伞 形酮-β-D-磷酸酯(MUF-P)和4-甲基伞形酮-β-D-木糖苷(MUF-X)配置成浓度为100μM的酶底 物缓冲液；将孔径为0.45μm的聚酰胺膜裁剪成3×5cm2大小，在配置的酶底物缓冲液中浸泡 8～12min，风干2～4min后将其与不同浓度DBP暴露的幼苗叶片表面紧密贴合；使用亚克力 板固定并在两面各施予1.0kg的压力，于暗室中反应30～40min。反应结束后，将聚酰胺膜小 心的从叶片表面剥离并置于激发波长为355nm，发射波长为460nm的紫外灯下，对聚酰胺膜 进行拍摄，获得叶片酶谱图像； (3)标曲制作：配置一系列浓度(0，4，8，10，15，20，40，80，100，200，400μM)的4-MUF 溶液，以未添加4-MUF的缓冲液为空白对照，将聚酰胺膜于缓冲液中浸泡8～12min；再将上 述系列浓度的4-MUF溶液滴加到风干的聚酰胺膜上，使用与S2酶谱成像相同的拍摄条件进 行拍摄，获得标曲图像； (4)图像处理：将S3获得的标曲图像，原始图像转化为8-bit灰阶图，以σG＝0.5的 高斯滤波核进行降噪，再以灰度值为98作为全局阈值对所有降噪后的梯度浓度标准荧光灰 阶图进行图像分割并计算灰度均值，最终得到扣除背景的梯度浓度标准荧光均值，然后根 据不同浓度的标准荧光产物与其图像灰度的变化拟合出分段校正曲线： 其中 为施加于膜上的MUF浓度；a1，a2，b1，b2是线性回归拟合的参数；G*为分 断点处的灰度值； 是经过分割的图像的平均灰度值；分段校正曲线的第一部分用于将酶 谱中的像素灰度值转化为酶活性，并将校正曲线中的灰度值赋予成比例关系的RGB颜色，获 得的RGB颜色条将用于创建查找表LUT，用于生成伪彩色叶片酶谱图；将S2获得的叶片酶谱 图像转化为8-bit灰阶图，以σG＝0.5的高斯滤波核进行降噪，记录各图像四角5×5范围内 的灰度均值，以此作为图像的背景灰度并在全图扣除得到最终的灰度图像，然后将LUT应用 于叶片图像，从而将叶片酶活性的空间分布可视化。 本发明还保护上述任一所述方法在污染物胁迫下的植物毒性评价和生理反应检 5 CN 111593090 A 说　明　书 4/10 页 测中的应用。 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明提供了一种污染物胁迫下植物中酶活性的原位可视化测定方法，弥补了现 有技术中植物叶片酶谱的技术空白。同时，本发明针对叶片酶谱，通过提供一系列的图像处 理手段，重建叶片酶谱高质量图像从而提高其定性准确性的有用信息，具有较大的应用前 景。 附图说明 图1为本发明开发的植物酶谱原位可视化方法的技术流程示意图。 图2为本发明植物酶谱原位可视化方法中饱和底物膜孵育及反应示意图。 图3为本发明植物酶谱原位可视化方法中图像处理流程示意图。 图4为本发明植物酶谱原位可视化方法中标准曲线绘制。 图5为本发明植物酶谱原位可视化方法中图像降噪结果；(a)FFT图像的灰度径向 分布图；(b)不同浓度MUF下预处理对图像分析的影响。 图6为实施例1中DBP胁迫下植物叶片酶谱图及热区分析：(a)木聚糖酶；(b)磷酸 酶；(c)β-葡萄糖苷酶。 图7为实施例1中DBP胁迫下叶片酶活性沿主叶脉的变化。 图8为实施例1中DBP胁迫下叶片总酶活性的定量分析：(a)叶片酶谱法；(b)生化分 析法。 图9为不同浓度MUF的标曲图像：(a)空域图；(b)频域图。 图10为降噪处理后标曲图像的灰度直方图。