技术摘要：
本发明公开了一种用于末段DNA片段处理的试剂及其制备方法，试剂主要成分为蛋白酶K、表面活性剂、离液剂、DNA切割剂和蒸馏水，具体制备方法如下：将Tris‑HCl溶液和的醋酸钙溶液按体积比1：1混合，然后加入蛋白酶K配制成溶液一；将表面活性剂溶于蒸馏水中，配制成溶液二 全部
背景技术：
基因测序是基因检测的方法之一，其又叫基因谱测序，是国际上公认的一种基因 检测标准。进行基因测序的第一步，需要进行样本的核酸提取，核酸的提取通常需要分离 DNA或RNA与样品源中的其他组分，以使多核酸不含其他细胞酶、蛋白质、化合物和/或碎片， 在对核酸进行提取前需要对组织细胞进行处理，目前常用的方法是在组织细胞中加入蛋白 酶和表面活性剂等对细胞膜上的蛋白质和和脂类进行溶解或水解，从而使细胞膜破碎。 目前对核酸的分离纯化需要使用表面活性剂对细胞进行溶解，从而使细胞中的 DNA从细胞中游离出来，进一步处理，因此需要一种对蛋白质有很高亲和性的表面活性剂， 易于溶解细胞，加快细胞的溶解速率，提高实验效率。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于末段DNA片段处理的试剂及其制备方法可以解决 问题如下： 1、以三聚氯氰为原料，合成了一种分子结构中具有两条疏水脂肪链和两个亲水的 磺酸基的表面活性剂，可以有效提高蛋白质溶解速率； 2、以三乙烯四胺为原料，合成了一种DNA切割剂，可以有效对DNA片段进行处理。 本发明的目的可以通过以下技术方案实现： 一种用于末段DNA片段处理的试剂，所述试剂主要成分为蛋白酶K、表面活性剂、离 液剂、DNA切割剂和蒸馏水，具体制备方法如下： S1、将50-100mmol/L的Tris-HCl溶液和1-2mmol/L的醋酸钙溶液按体积比1：1混 合，然后加入蛋白酶K配制成蛋白酶K浓度为10-20mg/mL的溶液一； S2、将表面活性剂溶于蒸馏水中，配制成质量浓度为5-10％的溶液二； S3、将离液剂溶于蒸馏水中，配制成浓度为3-6mol/L的溶液三； S4、将DNA切割剂溶于蒸馏水中，配置成浓度为1-5μg/L的溶液四； S5、将溶液一、溶液二、溶液三和溶液四按体积比1：3-5：2-5：1-2混合，得到一种用 于末段DNA片段处理的试剂。 优选的，所述表面活性剂的具体合成步骤如下： SS1、氮气保护下，将三聚氯氰和甲苯加入反应瓶中，搅拌至三聚氯氰完全溶解，降 温至0-5℃，将脂肪胺溶于甲苯中，并滴入反应瓶中，滴毕向反应瓶中加入碳酸钠的去离子 水溶液，搅拌反应3-5h，将反应液过滤，滤液用分液漏斗分液除去水相，有机相用稀盐酸洗 涤，除去过量的胺，再用去离子水洗涤至中性，最后经无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压浓 缩，得到中间体一,反应方程式如下： 4 CN 111575274 A 说 明 书 2/6 页 SS2、氮气保护下，将中间体一与丙酮加入反应瓶中，搅拌至中间体一完全溶解，加 热至40-50℃，将氨基乙磺酸溶于去离子水中，并加入碳酸钠，将氨基乙磺酸溶液滴入反应 瓶中，搅拌反应4-6h，将反应液冷却至室温，用稀盐酸洗涤至pH＝2-3后过滤，滤饼干燥得中 间体二，反应方程式如下： SS3、将中间体二加入反应瓶中，并加入乙二醇、四丁基溴化铵和去离子水，将反应 液降温0-10℃，加入氢氧化钾，搅拌并加热至90-100℃，反应6-10h，将反应液冷却至室温， 用稀盐酸洗涤至pH＝2-3后，用乙酸乙酯萃取反应液，有机相经无水硫酸钠干燥后过滤，滤 液减压浓缩得表面活性剂，反应方程式如下： 在三聚氯氰的结构中，均三嗪环具有很高的稳定性，由于环中氮原子带有一对未 成键的孤对电子，碳原子电子云密度较低，极易被给电子基团如氨基、羟基、巯基等官能团 进攻而发生亲核取代反应，利用这种特性，将三聚氯氰与氨基化合物反应，使分子上连接不 同的基团，因此，本发明在三聚氯氰分子上通过亲核取代反应连接脂肪胺和磺酸基，通过乙 二醇将两个均三嗪环连接起来，得到Gemini型表面活性剂，使表面活性剂分子具有细胞溶 解性。 优选的，步骤SS1中所述所述三聚氯氰和脂肪胺的摩尔比为1：1-1 .5，碳酸钠溶液 的浓度为2mol/L，每克三聚氯氰加入10-20mL甲苯和10-15mL碳酸钠溶液，脂肪胺为正己胺、 正辛胺、十二胺和十四胺中的一种。 优选的，步骤SS2中所述中间体一、氨基乙磺酸和碳酸钠的摩尔比为1：0.9-1.5：1- 1.5，每克氨基乙磺酸加去离子水20-40mL，每克中间体一加丙酮5-15mL。 优选的，步骤SS3中所述中间体二、乙二醇、四丁基溴化铵和氢氧化钾的摩尔比为 1：0.5-0.8：0.005-0.01：1-1.5，每克中间体二加入5-12mL水。 优选的，所述离液剂选自硫氰酸胍、硫氰酸钠、盐酸胍、碘化钠和尿素中的一种。 优选的，所述DNA切割剂的具体制备方法如下： 5 CN 111575274 A 说 明 书 3/6 页 第一步，将三乙烯四胺和无水乙醇加入反应瓶中，冷却至0-5℃，将对苯二甲醛溶 于乙醇中，配制成0.5mol/L的对苯二甲醛乙醇溶液，将对苯二甲醛乙醇溶液加入反应瓶中， 升温至30-40℃搅拌反应10-16h，将反应液减压蒸出溶剂，然后经洗涤、干燥、重结晶得到配 体； 第二步，将配体与氯化铜分别溶于无水乙醇中，搅拌下将氯化铜的乙醇溶液滴入 配体的乙醇溶液中，加热至60-70℃反应2-5h，冷却过滤，滤饼干燥后得DNA切割剂。 DNA切割剂能够有效地对DNA分子链中磷酸二酯键的P-O键进行裂解，且裂解过程 中不会产生对人体有害的自由基，通过以三乙烯四胺和苯二甲醛为原料，首先合成了大环 多胺类配体，然后将配体与铜盐进行络合反应得到DNA切割剂，DNA切割剂断裂P-O键主要通 过配合物作用下产生单线态氧自由基，并伴随有羟基自由基和超氧阴离子的氧化断裂。 优选的，第一步中所述三乙烯四胺与对苯二甲醛的摩尔比为1：1-1.2，每克三乙烯 四胺使用8-15mL无水乙醇，第二步中所述配体与氯化铜的摩尔比为1：0.9-1.1,每克配体所 用无水乙醇为8-12mL，每克氯化铜所用无水乙醇为8-12mL。 本发明的有益效果为： 通过使用蛋白酶K、表面活性剂、离液剂和DNA切割剂制备出用于DNA片段处理的试 剂，该试剂制备简单，其中表面活性剂为Gemini型表面活性剂，其分子结构中具有两条疏水 脂肪链和两个亲水的磺酸基，该表面活性剂相比传统表面活性剂具有更高的表面活性、更 好的水溶性和更低的临界胶团浓度，在降低水的表面张力方面也表现出更高的效率，在盐 中不同的聚集态和偶联表面活性剂特殊的分子结构使其与蛋白质或脂类生物分子的作用 比其它表面活性剂更强烈，在对组织细胞进行处理时，蛋白酶和表面活性剂聚集体间强烈 额静电斥力使蛋白质分子伸展并引起蛋白变性，从而溶解细胞，细胞中的DNA由于细胞的溶 化，从细胞中游离出来，可以有效对DNA片段进行处理； 在三聚氯氰的结构中，均三嗪环具有很高的稳定性，由于环中氮原子带有一对未 成键的孤对电子，碳原子电子云密度较低，极易被给电子基团如氨基、羟基、巯基等官能团 进攻而发生亲核取代反应，利用这种特性，将三聚氯氰与氨基化合物反应，使分子上连接不 同的基团，因此，本发明在三聚氯氰分子上通过亲核取代反应连接脂肪胺和磺酸基，通过乙 二醇将两个均三嗪环连接起来，得到Gemini型表面活性剂，使表面活性剂分子具有细胞溶 解性； 离液剂具有破坏水分子结构稳定性的特点，作用于疏水性分子，能够增加分子的 水溶性，与表面活性剂配合使用，可以加快蛋白质和脂类物质的消解速度，提高处理效率； DNA切割剂能够有效地对DNA分子链中磷酸二酯键的P-O键进行裂解，且裂解过程 中不会产生对人体有害的自由基，通过以三乙烯四胺和苯二甲醛为原料，首先合成了大环 多胺类配体，然后将配体与铜盐进行络合反应得到DNA切割剂，DNA切割剂断裂P-O键主要通 过配合物作用下产生单线态氧自由基，并伴随有羟基自由基和超氧阴离子的氧化断裂。
本发明公开了一种用于末段DNA片段处理的试剂及其制备方法，试剂主要成分为蛋白酶K、表面活性剂、离液剂、DNA切割剂和蒸馏水，具体制备方法如下：将Tris‑HCl溶液和的醋酸钙溶液按体积比1：1混合，然后加入蛋白酶K配制成溶液一；将表面活性剂溶于蒸馏水中，配制成溶液二 全部
背景技术：
基因测序是基因检测的方法之一，其又叫基因谱测序，是国际上公认的一种基因 检测标准。进行基因测序的第一步，需要进行样本的核酸提取，核酸的提取通常需要分离 DNA或RNA与样品源中的其他组分，以使多核酸不含其他细胞酶、蛋白质、化合物和/或碎片， 在对核酸进行提取前需要对组织细胞进行处理，目前常用的方法是在组织细胞中加入蛋白 酶和表面活性剂等对细胞膜上的蛋白质和和脂类进行溶解或水解，从而使细胞膜破碎。 目前对核酸的分离纯化需要使用表面活性剂对细胞进行溶解，从而使细胞中的 DNA从细胞中游离出来，进一步处理，因此需要一种对蛋白质有很高亲和性的表面活性剂， 易于溶解细胞，加快细胞的溶解速率，提高实验效率。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于末段DNA片段处理的试剂及其制备方法可以解决 问题如下： 1、以三聚氯氰为原料，合成了一种分子结构中具有两条疏水脂肪链和两个亲水的 磺酸基的表面活性剂，可以有效提高蛋白质溶解速率； 2、以三乙烯四胺为原料，合成了一种DNA切割剂，可以有效对DNA片段进行处理。 本发明的目的可以通过以下技术方案实现： 一种用于末段DNA片段处理的试剂，所述试剂主要成分为蛋白酶K、表面活性剂、离 液剂、DNA切割剂和蒸馏水，具体制备方法如下： S1、将50-100mmol/L的Tris-HCl溶液和1-2mmol/L的醋酸钙溶液按体积比1：1混 合，然后加入蛋白酶K配制成蛋白酶K浓度为10-20mg/mL的溶液一； S2、将表面活性剂溶于蒸馏水中，配制成质量浓度为5-10％的溶液二； S3、将离液剂溶于蒸馏水中，配制成浓度为3-6mol/L的溶液三； S4、将DNA切割剂溶于蒸馏水中，配置成浓度为1-5μg/L的溶液四； S5、将溶液一、溶液二、溶液三和溶液四按体积比1：3-5：2-5：1-2混合，得到一种用 于末段DNA片段处理的试剂。 优选的，所述表面活性剂的具体合成步骤如下： SS1、氮气保护下，将三聚氯氰和甲苯加入反应瓶中，搅拌至三聚氯氰完全溶解，降 温至0-5℃，将脂肪胺溶于甲苯中，并滴入反应瓶中，滴毕向反应瓶中加入碳酸钠的去离子 水溶液，搅拌反应3-5h，将反应液过滤，滤液用分液漏斗分液除去水相，有机相用稀盐酸洗 涤，除去过量的胺，再用去离子水洗涤至中性，最后经无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压浓 缩，得到中间体一,反应方程式如下： 4 CN 111575274 A 说 明 书 2/6 页 SS2、氮气保护下，将中间体一与丙酮加入反应瓶中，搅拌至中间体一完全溶解，加 热至40-50℃，将氨基乙磺酸溶于去离子水中，并加入碳酸钠，将氨基乙磺酸溶液滴入反应 瓶中，搅拌反应4-6h，将反应液冷却至室温，用稀盐酸洗涤至pH＝2-3后过滤，滤饼干燥得中 间体二，反应方程式如下： SS3、将中间体二加入反应瓶中，并加入乙二醇、四丁基溴化铵和去离子水，将反应 液降温0-10℃，加入氢氧化钾，搅拌并加热至90-100℃，反应6-10h，将反应液冷却至室温， 用稀盐酸洗涤至pH＝2-3后，用乙酸乙酯萃取反应液，有机相经无水硫酸钠干燥后过滤，滤 液减压浓缩得表面活性剂，反应方程式如下： 在三聚氯氰的结构中，均三嗪环具有很高的稳定性，由于环中氮原子带有一对未 成键的孤对电子，碳原子电子云密度较低，极易被给电子基团如氨基、羟基、巯基等官能团 进攻而发生亲核取代反应，利用这种特性，将三聚氯氰与氨基化合物反应，使分子上连接不 同的基团，因此，本发明在三聚氯氰分子上通过亲核取代反应连接脂肪胺和磺酸基，通过乙 二醇将两个均三嗪环连接起来，得到Gemini型表面活性剂，使表面活性剂分子具有细胞溶 解性。 优选的，步骤SS1中所述所述三聚氯氰和脂肪胺的摩尔比为1：1-1 .5，碳酸钠溶液 的浓度为2mol/L，每克三聚氯氰加入10-20mL甲苯和10-15mL碳酸钠溶液，脂肪胺为正己胺、 正辛胺、十二胺和十四胺中的一种。 优选的，步骤SS2中所述中间体一、氨基乙磺酸和碳酸钠的摩尔比为1：0.9-1.5：1- 1.5，每克氨基乙磺酸加去离子水20-40mL，每克中间体一加丙酮5-15mL。 优选的，步骤SS3中所述中间体二、乙二醇、四丁基溴化铵和氢氧化钾的摩尔比为 1：0.5-0.8：0.005-0.01：1-1.5，每克中间体二加入5-12mL水。 优选的，所述离液剂选自硫氰酸胍、硫氰酸钠、盐酸胍、碘化钠和尿素中的一种。 优选的，所述DNA切割剂的具体制备方法如下： 5 CN 111575274 A 说 明 书 3/6 页 第一步，将三乙烯四胺和无水乙醇加入反应瓶中，冷却至0-5℃，将对苯二甲醛溶 于乙醇中，配制成0.5mol/L的对苯二甲醛乙醇溶液，将对苯二甲醛乙醇溶液加入反应瓶中， 升温至30-40℃搅拌反应10-16h，将反应液减压蒸出溶剂，然后经洗涤、干燥、重结晶得到配 体； 第二步，将配体与氯化铜分别溶于无水乙醇中，搅拌下将氯化铜的乙醇溶液滴入 配体的乙醇溶液中，加热至60-70℃反应2-5h，冷却过滤，滤饼干燥后得DNA切割剂。 DNA切割剂能够有效地对DNA分子链中磷酸二酯键的P-O键进行裂解，且裂解过程 中不会产生对人体有害的自由基，通过以三乙烯四胺和苯二甲醛为原料，首先合成了大环 多胺类配体，然后将配体与铜盐进行络合反应得到DNA切割剂，DNA切割剂断裂P-O键主要通 过配合物作用下产生单线态氧自由基，并伴随有羟基自由基和超氧阴离子的氧化断裂。 优选的，第一步中所述三乙烯四胺与对苯二甲醛的摩尔比为1：1-1.2，每克三乙烯 四胺使用8-15mL无水乙醇，第二步中所述配体与氯化铜的摩尔比为1：0.9-1.1,每克配体所 用无水乙醇为8-12mL，每克氯化铜所用无水乙醇为8-12mL。 本发明的有益效果为： 通过使用蛋白酶K、表面活性剂、离液剂和DNA切割剂制备出用于DNA片段处理的试 剂，该试剂制备简单，其中表面活性剂为Gemini型表面活性剂，其分子结构中具有两条疏水 脂肪链和两个亲水的磺酸基，该表面活性剂相比传统表面活性剂具有更高的表面活性、更 好的水溶性和更低的临界胶团浓度，在降低水的表面张力方面也表现出更高的效率，在盐 中不同的聚集态和偶联表面活性剂特殊的分子结构使其与蛋白质或脂类生物分子的作用 比其它表面活性剂更强烈，在对组织细胞进行处理时，蛋白酶和表面活性剂聚集体间强烈 额静电斥力使蛋白质分子伸展并引起蛋白变性，从而溶解细胞，细胞中的DNA由于细胞的溶 化，从细胞中游离出来，可以有效对DNA片段进行处理； 在三聚氯氰的结构中，均三嗪环具有很高的稳定性，由于环中氮原子带有一对未 成键的孤对电子，碳原子电子云密度较低，极易被给电子基团如氨基、羟基、巯基等官能团 进攻而发生亲核取代反应，利用这种特性，将三聚氯氰与氨基化合物反应，使分子上连接不 同的基团，因此，本发明在三聚氯氰分子上通过亲核取代反应连接脂肪胺和磺酸基，通过乙 二醇将两个均三嗪环连接起来，得到Gemini型表面活性剂，使表面活性剂分子具有细胞溶 解性； 离液剂具有破坏水分子结构稳定性的特点，作用于疏水性分子，能够增加分子的 水溶性，与表面活性剂配合使用，可以加快蛋白质和脂类物质的消解速度，提高处理效率； DNA切割剂能够有效地对DNA分子链中磷酸二酯键的P-O键进行裂解，且裂解过程 中不会产生对人体有害的自由基，通过以三乙烯四胺和苯二甲醛为原料，首先合成了大环 多胺类配体，然后将配体与铜盐进行络合反应得到DNA切割剂，DNA切割剂断裂P-O键主要通 过配合物作用下产生单线态氧自由基，并伴随有羟基自由基和超氧阴离子的氧化断裂。
