技术摘要：
本发明公开了一种同时检测包括SARS‑CoV‑2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明的试剂盒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒、鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒229E亚型、冠状病毒OC43亚型、冠状病毒HKU1亚型的引物组  全部
背景技术：
聚合酶链式反应(Polymerase  Chain  Reaction)是在DNA聚合酶催化下，以母链 DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板 DNA互补的子链DNA的过程。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成， 通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部 分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为 起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链。 实时荧光定量PCR(Quantitative  Real-time  PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧 光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对 待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。TaqMan探针法实时荧光定量PCR原理是， 当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切 酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收 到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产 物的形成完全同步。 流感是由流感病毒引起的一种急性病毒性呼吸道感染，传染性强，发病率高，其中 甲型流感病毒的流行性比乙型流感病毒更强，症状更严重。2019新型冠状病毒(SARS-CoV- 2)是2019年在人体中发现的冠状病毒新毒株。该病毒引起的症状一般为发热、乏力、干咳、 逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸 中毒和凝血功能障碍。该病毒存在人传人现象，病毒潜伏期一般为1～14天，潜伏期具有传 染性。 在成年人和儿童中，发热伴呼吸道症候群是最普遍的急性传染病，对于患者和公 共卫生部门来说，准确快速诊断由哪种病毒引起的呼吸道感染十分重要。目前新型冠状病 毒相关检测产品需求量较大，快速鉴别新型冠状病毒感染抑或是其他常见呼吸道病毒感染 成为临床和公共卫生部门亟需解决的问题。 开发一种快速便捷检测多种呼吸道病毒的检测试剂盒是亟需解决的问题。
技术实现要素：
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼 吸道病毒的检测试剂盒。本发明针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒SARS- CoV-2、鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒229E亚型、冠状病毒OC43亚型、冠状 病毒HKU1亚型，开发了呼吸道病毒多重检测体系。能够高效率、高特异性、低成本的对呼吸 4 CN 111593142 A 说　明　书 2/12 页 道病毒感染患者进行检测，有助于快速筛查新型冠状病毒SARS-CoV-2感染患者和其他呼吸 道病毒感染患者。 本发明的技术方案为： 一种同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒，包括检测甲型流 感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒SARS-CoV-2、鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、 冠状病毒229E亚型、冠状病毒OC43亚型、冠状病毒HKU1亚型的引物组、探针组； 检测甲型流感病毒的上游引物的序列如SEQ  ID  No.1所示，下游引物的序列如SEQ  ID  No.2所示，荧光探针的序列如SEQ  ID  No.3所示； 检测乙型流感病毒的上游引物的序列如SEQ  ID  No.4所示，下游引物的序列如SEQ  ID  No.5所示，荧光探针的序列如SEQ  ID  No.6所示； 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的上游引物的序列如SEQ  ID  No.7所示，下游引物 的序列如SEQ  ID  No.8所示，荧光探针的序列如SEQ  ID  No.9所示； 检测鼻病毒的上游引物的序列如SEQ  ID  No .10所示，下游引物的序列如SEQ  ID  No.11所示，荧光探针的序列如SEQ  ID  No.12所示； 检测副流感病毒的上游引物的序列如SEQ  ID  No.13所示，下游引物的序列如SEQ  ID  No.14所示，荧光探针的序列如SEQ  ID  No.15所示； 检测呼吸道合胞病毒的上游引物的序列如SEQ  ID  No.16所示，下游引物的序列如 SEQ  ID  No.17所示，荧光探针的序列如SEQ  ID  No.18所示； 检测冠状病毒229E亚型的上游引物的序列如SEQ  ID  No.19所示，下游引物的序列 如SEQ  ID  No.20所示，荧光探针的序列如SEQ  ID  No.21所示； 检测冠状病毒OC43亚型的上游引物的序列如SEQ  ID  No.22所示，下游引物的序列 如SEQ  ID  No.23所示，荧光探针的序列如SEQ  ID  No.24所示； 检测冠状病毒HKU1亚型的上游引物的序列如SEQ  ID  No.25所示，下游引物的序列 如SEQ  ID  No.26所示，荧光探针的序列如SEQ  ID  No.27所示。 作为优选方案，所述引物组、探针组具体为引物探针混合液A、引物探针混合液B、 引物探针混合液C； 所述引物探针混合液A包括检测甲型流感病毒的上游引物、下游引物和荧光探针， 检测乙型流感病毒的上游引物、下游引物和荧光探针，检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的上 游引物、下游引物和荧光探针； 所述引物探针混合液B包括检测鼻病毒的上游引物、下游引物和荧光探针，检测副 流感病毒的上游引物、下游引物和荧光探针，检测呼吸道合胞病毒的的上游引物、下游引物 和荧光探针； 所述引物探针混合液C包括检测冠状病毒229E亚型的上游引物、下游引物和荧光 探针，检测冠状病毒OC43亚型的上游引物、下游引物和荧光探针，检测冠状病毒HKU1亚型的 上游引物、下游引物和荧光探针。 进一步地，还包括阳性质控品A、阳性质控品B、阳性质控品C和阴性质控品； 所述阳性质控品A为含甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒SARS-CoV-2基 因特异性片段的质粒； 所述阳性质控品B为含鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒特异性片段的质粒； 5 CN 111593142 A 说　明　书 3/12 页 所述阳性质控品C为含冠状病毒229E亚型、冠状病毒OC43亚型、冠状病毒HKU1亚型 特异性片段的质粒； 所述阴性质控品包括DEPC处理水。 作为优选方案，检测甲型流感病毒、鼻病毒和冠状病毒229E亚型的荧光探针的荧 光基团为FAM基团，淬灭基团为BHQ1。 作为优选方案，检测乙型流感病毒、副流感病毒和冠状病毒OC43亚型的荧光探针 的荧光基团为CY5基团，淬灭基团为BHQ3。 作为优选方案，检测新型冠状病毒SARS-CoV-2、呼吸道合胞病毒、冠状病毒HKU1亚 型的荧光探针的荧光基团为ROX基团，淬灭基团为BHQ2。 作为优选方案，还包括反应液、酶混合液；所述反应液包括Tris-HCl缓冲液、 dNTPs、Mg2 、Tween-20和甜菜碱；所述酶混合液包括DNA聚合酶和反转录酶。 进一步地，反应液中Tris-HCl缓冲液浓度为10mM；dNTPs浓度为10mM；Mg2 浓度为 6mM；Tween-20含量为0.5％；甜菜碱浓度为1.5M。 作为优选方案，酶混合液中DNA聚合酶浓度为50U/μl；反转录酶浓度为20U/μl。 多重检测上述九种呼吸道病毒核酸的方法，所述方法包括步骤： (1)提供待检测对象的核酸样本； (2)配制RT-PCR反应体系并进行RT-PCR检测： 其中，所述RT-PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、引物探针混合液、 反应液、酶混合液。 所述核酸样本可来自咽拭子样本、鼻拭子样本、肺泡灌洗液样本、痰液样本。 本发明的有益效果为： 本发明可实现包括新型冠状病毒SARS-CoV-2在内的九种常见呼吸道病毒的快速 确认与筛查，同时本发明使用实时荧光定量PCR技术，试剂盒具备灵敏度高，特异性好。 附图说明 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。 图1为甲型流感病毒样本扩增曲线； 图2为乙型流感病毒样本扩增曲线； 图3为新型冠状病毒SARS-CoV-2样本扩增曲线； 图4为鼻病毒样本扩增曲线； 图5为副流感病毒样本扩增曲线； 图6为呼吸道合胞病毒样本扩增曲线； 图7为冠状病毒229E亚型样本扩增曲线； 图8为冠状病毒OC43亚型样本扩增曲线； 图9为冠状病毒HKU1亚型样本扩增曲线； 图10为甲型流感病毒灵敏度扩增曲线； 6 CN 111593142 A 说　明　书 4/12 页 图11为乙型流感病毒灵敏度扩增曲线； 图12为新型冠状病毒SARS-CoV-2灵敏度扩增曲线； 图13为鼻病毒灵敏度扩增曲线； 图14为副流感病毒灵敏度扩增曲线； 图15为呼吸道合胞病毒灵敏度扩增曲线； 图16为冠状病毒229E亚型灵敏度扩增曲线； 图17为冠状病毒OC43亚型灵敏度扩增曲线； 图18为冠状病毒HKU1亚型灵敏度扩增曲线。