技术摘要：
本发明涉及一种革兰氏阴性菌抗菌药物组合物，由苦柯胺B和β‑内酰胺类抗生素组成，还可以进一步加入β‑内酰胺酶抑制剂从而增加组合物的抗菌活性，经动物试验证明，本发明所公开的抗菌药物组合物，比单独应用β‑内酰胺类抗生素或苦柯胺B，对试验动物的保护作用更强。 全部
背景技术：
细菌大概可以分为两种：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。在革兰氏测试中，向细菌 培养皿中加入一种紫色染料，如果细菌变为紫色，则称革兰氏阳性菌，而革兰氏阴性菌只会 变为红色或粉红色。革兰氏阴性菌往往比阳性菌更具有耐药性，因为它们有更坚固的细胞 壁。MRSA(抗甲氧西林金黄色葡萄球菌)感染和痤疮都是由于革兰氏阳性菌，莱姆病和肺炎 的罪魁祸首则是革兰氏阳性菌。 革兰氏阴性菌的病原能力通常与其细胞壁组成相关，具体说来有脂多糖 (lipopoly-saccharide)，又称为LPS或者内毒素(endotoxin)层。 内毒素为革兰氏阴性菌(如伤寒杆菌，结核杆菌，痢疾杆菌等)的菌体中存在的毒 性物质的总称。是多种革兰氏阴性菌的细胞壁成分，由菌体裂解后释出的毒素，又称之为 “热原”。单位Eu/ml。其化学成分有磷脂多糖-蛋白质复合物，其毒性成分主要为类脂质A。内 毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的黏肽上。 各种细菌的内毒素的毒性作用大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及 弥漫性血管内凝血等。内毒素耐热而稳定，抗原性弱。可刺激机体产生抗体，但无中和作用， 形成抗毒素，经甲醛处理不能成为类毒素。 内毒素脂多糖分子由菌体特异性多糖、非特异性核心多糖和脂质A三部分构成。脂 质A是内毒素的主要毒性组分。不同革兰氏阴性细菌的脂质A结构基本相似。因此，凡是由革 兰氏阴性菌引起的感染，虽菌种不一，其内毒素导致的毒性效应大致类同。这些毒性反应主 要有。 发热反应。人体对细菌内毒素极为敏感。极微量(1-5纳克/公斤体重)内毒素就能 引起体温上升，发热反应持续约4小时后逐渐消退。自然感染时，因革兰氏阴性菌不断生长 繁殖，同时伴有陆续死亡、释出内毒素，故发热反应将持续至体内病原菌完全消灭为止。内 毒素引起发热反应的原因是内毒素作用于体内的巨噬细胞等，使之产生白细胞介素1、6和 肿瘤坏死因子α等细胞因子，这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢，促使体温升 高发热。 白细胞反应。细菌内毒素进入宿主体内以后，血流中占白细胞总数60％-70％的中 性粒细胞数量迅速减少，这是因为细胞发生移动并粘附到组织毛细血管上。不过1-2小时 后，由内毒素诱生的中性细胞释放因子刺激骨髓释放其中的中性粒细胞进入血流，使其数 量显著增加，有部分不成熟的中性粒细胞也被释放出来。由于绝大多数被革兰氏阴性菌感 染的患者血流中白细胞总数都会增加，所以现在医生在诊断前，为了初步区别是细菌性感 染还是病毒性感染，常常要化验病人的血液，对白细胞进行总数测定和分类计数。被病毒感 染的病人，其白细胞总数和中性粒细胞百分比基本在正常值范围内。 3 CN 111603563 A 说 明 书 2/18 页 内毒素血症与内毒素休克。当病灶或血流中革兰氏阴性病原菌大量死亡，释放出 来的大量内毒素进入血液时，可发生内毒素血症。大量内毒素作用于机体的巨噬细胞、中性 粒细胞、内皮细胞、血小板，以及补体系统和凝血系统等，便会产生白细胞介素1、6、8和肿瘤 坏死因子α、组胺、5-羟色胺、前列腺素、激肽等生物活性物质。这些物质作用于毛细血管造 成功能紊乱而导致微循环障碍，临床表现为微循环衰竭、低血压、缺氧、酸中毒等，于是导致 病人休克，这种病理反应叫做内毒素休克。 关于内毒素休克，过去曾有过惨痛的教训。20世纪40年代青霉素刚问世的时候，医 生发现青霉素对脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑膜炎疗效非常显著。因此，凡发现这类病人， 一律优选青霉素进行治疗；且按照一般规律，用药剂量随病情严重程度而递增。结果发生了 意外，用大剂量青霉素治疗重症脑膜炎患者时，不少病人发生内毒素休克而死亡。后来经过 研究分析，发现了其中的原委。病情严重的患者，体内存在的病原菌数量多，医生采用大剂 量“轰炸”，意欲“一举歼敌”。快速、彻底杀灭病原体，这种战略无可非议，但有些医生忽略了 另一方面，即流行性脑膜炎的病原菌是属革兰氏阴性菌的脑膜炎奈瑟菌，其致病物质是内 毒素，而内毒素是要在病菌死亡后再放出的。如今用大剂量青霉素一下子将全部病菌杀死， 也就是使大量内毒素一次放出，促成了内毒素休克，加速了患者的死亡。随着医学的进步， 现在医生遇到这类病人，一方面仍然要用大剂量的有效抗菌药物去对付，同时要加用激素 类药物，以保护对内毒素敏感的细胞不对内毒素诱生的细胞因子发生反应，从而度过“休 克”难关。犹如外科手术时，采用麻醉药使病人丧失痛觉一样。 可以说由于革兰氏阴性细菌感染引起的各种症状，其主要致病因素就是内毒素。 革兰氏阴性菌，以大肠杆菌为代表。除了大肠杆菌外，变形杆菌、铜绿假单胞菌、痢 疾杆菌、肺炎克雷伯杆菌、布氏杆菌、流感(嗜血)杆菌、副流感(嗜血)杆菌、卡他(摩拉)菌、 不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、 霍乱弧菌、副溶血性杆菌、类志贺吡邻单胞菌等也是革兰氏阴性菌。可见，革兰氏阴性菌以 杆菌最为常见。 革兰阴性菌感染，常见有脑膜炎球菌，痢疾、伤寒、副伤寒、沙门、肉毒杆菌等，与医 院内感染中常见的肠、肺炎克雷伯菌、变形、铜绿假单胞菌以及其他少见的军团病菌和淋球 菌等。其引起的常见疾病如流行性脑脊液髓膜炎、淋病，细菌性痢疾、霍乱、伤寒与副伤寒， 甚至败血症从而威胁生命。 β-内酰胺类抗生素(Beta-lactam antibiotic)是一种种类很广的抗生素，其中包 括青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类、碳青霉烯和青霉烯类酶抑制剂等。基本上所 有在其分子结构中包括β-内酰胺核的抗生素均属于β-内酰胺类抗生素。它是现有的抗生素 中使用最广泛的一类。 β-内酰胺类抗生素是一种杀菌剂，它抑制细菌细胞壁中肽聚糖的形成。肽聚糖影 响细菌的细胞壁很大、尤其在革兰氏阳性菌细胞壁的结构强度。肽聚糖合成的最后一步被 称为青霉素结合蛋白的转肽酶形成。 由于抗生素的大量应用，细菌本身产生β-内酰胺酶，用于水解掉β-内酰胺类抗生 素，从而使其失去杀菌效力，故抗生素中常加入β-内酰胺酶抑制剂，用以增加抗生素的杀菌 效力。 目前常用β-内酰胺酶抑制剂，例如克拉维酸，舒巴坦，他唑巴坦等，作为β-内酰胺 4 CN 111603563 A 说 明 书 3/18 页 类抗生素的抗菌增效剂。用于抑制细菌产生β-内酰胺酶的能力，进一步杀死细菌。 目前的细菌感染治疗，其治疗方法均为杀死细菌，之后靠人体自身将细菌死亡所 产生的有毒物质(例如，内毒素)代谢掉。 并没有针对细菌死后所产生的内毒素的控制方法。更没有抗生素与内毒素控制联 用的治疗方式或药物组合。 地骨皮为茄科植物枸杞(Lycium chinense Mill.)或宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)的干燥根皮。在传统中医药理论中，地骨皮具有清热解毒功效。现代药理研究发现，地骨 皮主要含有生物碱类、有机酸类、蒽醌类和肽类成分，发挥降血压、降血糖、解热和镇痛等药 理作用。 苦柯胺B，是从中药地骨皮中提取得到的生物碱，有报道显示其具有多种药理活 性。 其化学结构如下： 中国专利201410403053.8，公开了包括地骨皮甲素(kukoamine A)和地骨皮乙素 (kukoamine B)中至少一种的组合物及其在改善骨健康以及治疗和/或预防骨疾病方法中 的用途。其作用机制为增加了碱性磷酸酶活性。 中国专利201010156503.X公开了苦柯胺A和苦柯胺B用于制备预防和治疗脓毒症 及自身免疫性疾病药物的用途。本发明以诱发脓毒症及自身免疫性疾病的主要病原分子细 菌内毒素(LPS)和细菌非甲基化DNA(CpG DNA)为靶点，从中药中定向分离药物先导化合物， 克服了现有中药组分和提取物物质基础和作用靶点不明的主要缺陷，研制一种安全、有效、 质量可控的新药物，以解决目前脓毒症及自身免疫性疾病缺乏有效治疗药物的问题。 中国专利201611040096.X，公开了地骨皮乙素(苦柯胺B)在制备治疗Ⅱ型糖尿病 药物中的应用。地骨皮乙素通过抑制二肽基肽酶4(DPP-4)活性，进而发挥降血糖的作用，因 此可将其应用于制备治疗糖尿病的药物中。本发明还提供了一种包括作为有效成分的地骨 皮乙素和药剂学上接受的药物赋形剂或载体的药物组合物，以地骨皮乙素为有效成分的药 物组合物可有效改善胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗水平，为糖尿病的防治提供新的药物选 择。 中国专利201310522480.3，公开了地骨皮醇提物及已获得的地骨皮甲素和地骨皮 乙素具有神经元修复及保护的新用途。其特征是地骨皮醇提物、地骨皮甲素及地骨皮乙素 可以作为治疗神经退行性疾病、创伤性脑损伤、中风中药物的应用。本发明的目的就是发掘 了具有咖啡酰胺结构及类咖啡酰胺结构的生物碱的神经保护前景，开拓了一个新的药用领 域。 5 CN 111603563 A 说 明 书 4/18 页
技术实现要素：
针对现有技术的不足，发明人经过研究，将β-内酰胺类抗生素与苦柯胺B按一定比 例制备成组合物，用于革兰氏阴性菌感染所致疾病，在杀灭细菌的同时，抑制其死亡后释放 的细菌内毒素引起的各种生理反应，例如常见的发热，白细胞升高，菌血症等等。 本发明所述药物组合物由苦柯胺B和β-内酰胺类抗生素组成，其特征在于，所述β- 内酰胺类抗生素为头孢菌素或青霉素类或碳青霉烯抗生素的一种。 所述苦柯胺B，为苦柯胺B的甲磺酸盐。 所述头孢菌素选自头孢哌酮钠，头孢他啶，头孢呋辛钠，头孢唑肟钠，拉氧头孢钠， 盐酸头孢替安，头孢唑林钠，头孢地嗪钠中的一种。 所述青霉素类抗生素选自哌拉西林钠，美洛西林钠中的一种。 所述碳青霉烯类抗生素选自美罗培南，亚胺培南中的一种。 所述药物组合物可以进一步加入β-内酰胺酶抑制剂，用于进一步增强疗效。 所述β-内酰胺酶抑制剂为克拉维酸钾，舒巴坦钠，他唑巴坦钠，西司他丁钠中的一 种。 所述药物组合物为注射用无菌粉末。 所述药物组合物中头孢菌素与苦柯胺B的质量比为2000：1-50:1。 所述药物组合物中青霉素类抗生素与苦柯胺B的质量比为3000:1-300:1。 药物组合物中碳青霉烯类抗生素与苦柯胺B的质量比为400:1-40:1。 据现有技术文献记载，上述头孢菌素，青霉素类，碳青霉烯类抗生素的抗菌谱如 下。 注射用美洛西林钠(1g)： 对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎杆菌、变形杆菌、肠杆菌属、枸橼酸杆菌、沙雷菌属、 不动杆菌属以及对青霉素敏感的革兰阳性球菌均有抑菌作用。 注射用头孢哌酮钠(1g)： 对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌属、伤寒沙门菌、志贺菌属、枸橼酸杆菌属等肠 杆菌科细菌和铜绿假单胞菌有良好抗菌作用。 注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠(2g，1:1)： 对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌属、变形杆菌属、伤寒沙门菌、志贺菌属、枸橼酸杆菌属等 肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌有良好抗菌作用。 注射用头孢他啶(1g)： 对铜绿假单胞菌等假单胞菌属、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌属、吲哚阳性及阴性变形杆 菌、普鲁威登菌、沙门菌属、沙雷菌属和志贺菌属等以及小肠结肠炎耶尔森菌等革兰阴性杆 菌具高度抗菌活性。 注射用哌拉西林钠(1g)： 对大肠埃希菌、变形杆菌属、沙雷菌属、肺炎克雷伯菌属、肠杆菌属、枸橼酸菌属、沙门 菌属和志贺菌属等肠杆菌科细菌，以及铜绿假单胞菌、不动杆菌属、流感嗜血杆菌、奈瑟菌 属等其他革兰阴性菌均具有良好抗菌作用。 注射用美罗培南(1g)： 对大肠杆菌、流感嗜血杆菌(β-内酰胺酶阳性菌株及β-内酰胺酶阴性菌株)、肺炎克雷 6 CN 111603563 A 说 明 书 5/18 页 伯菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟菌均具有良好抗菌作用。 注射用亚胺培南西司他丁钠(2g，1:1): 对革兰氏阴性需氧菌抗菌范围包括：无色杆菌属，不动杆菌属(以前称小小赫尔菌属)， 嗜水气单胞菌，产碱杆菌属，支气管博代氏杆菌，支气管败血症博代氏杆菌，博代百日咳杆 菌，马耳他布鲁氏杆菌，类鼻疽伯克霍尔德菌(以前称类鼻疽假单胞菌)，施氏伯克霍尔德菌 (以前称施氏假单细胞菌)，弯曲杆菌属，嗜二氧化碳噬细胞菌属，柠檬酸细菌属，弗氏柠檬 酸菌，克氏柠檬酸菌(以前称多样性柠檬酸菌)，分外埃肯杆菌族，肠杆菌属，产气杆菌，聚团 肠杆菌，阴沟肠杆菌，大肠杆菌，阴道加德诺菌属，杜克嗜血杆菌，流感嗜血杆菌(包括产β- 内酰胺酶菌株)，副流感嗜血杆菌，蜂房哈夫尼菌，克雷白氏杆菌属，奥克西托克雷白氏杆 菌，臭鼻肺炎克雷伯菌，肺炎杆菌，莫拉菌属，摩氏摩根菌(以前称摩氏变形菌)，淋病奈瑟球 菌(包括产生青霉素酶菌株)，脑膜炎奈瑟氏球菌，巴斯德菌属，多杀巴氏杆菌，类志贺邻单 胞菌，变形杆菌属，奇异变形杆菌，普通变形杆菌，普罗威登斯菌属，产碱普罗威登斯菌属， 雷氏普罗威登斯菌(以前称雷氏变形菌)，斯氏普罗威登斯菌，假单胞菌属，铜绿假单胞菌， 萤光假单胞菌，恶臭假单胞菌，沙门氏菌属，伤寒沙门氏菌，沙雷氏菌属，变斑沙雷氏菌(以 前称液化沙雷氏菌)，粘质沙雷氏菌，志贺氏菌属，涅尔森氏菌属(以前称巴斯德杆菌)，小肠 结肠炎涅尔森氏菌，假结核涅尔森氏菌均具有良好抗菌作用。 注射用头孢呋辛钠(1.5g)： 对大肠埃希菌、流感杆菌(包括产β-内酰胺酶菌)、副流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、卡 他莫拉菌(包括产β-内酰胺酶菌)、淋病奈瑟菌(包括产β-内酰胺酶菌)均具有良好抗菌作 用。 注射用头孢唑肟钠(1g)： 对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌等肠杆菌科细菌有强大抗菌作用。 注射用拉氧头孢钠(1g)： 对大肠杆菌、流感杆菌、肺炎克雷伯菌、各型变形杆菌、肠杆菌属、枸橼酸杆菌、沙雷杆 菌等对该品高度敏感。对厌氧菌有良好的抗菌作用。 注射用盐酸头孢替安(1g)： 对葡萄球菌属、链球菌属(场球菌除外)、肺炎球菌、流感杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌 属、肠道菌属、枸橼酸杆菌属、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、雷特格式变形杆菌、摩根氏变 形杆菌等均具有良好抗菌作用。 注射用头孢唑林钠(1g)： 对葡萄球菌(包括产酶菌株)、链球菌(肠球菌除外)、肺炎链球菌、大肠杆菌、奇异变形 杆菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌以及产气肠杆菌等有抗菌作用。 注射用头孢地嗪钠(1g)： 对金黄色葡萄菌(耐新青酶菌株例外)、肺炎链球菌、链球菌属、奈瑟氏淋球菌(包括产 生青霉素酶的菌株)、奈瑟氏脑膜炎双球菌、卡它氏Branhamlla菌、大肠杆菌、志贺氏菌属、 沙门氏菌属、柠檬酸细菌属、肺炎克雷伯菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、普罗维登斯菌、 莫尔加民氏摩根氏杆菌、流感嗜血杆菌及棒状杆菌均具有良好抗菌作用。 通过如下实验进一步说明本发明专利申请。 针对现有技术的不足，发明人通过研究，得到一种用于抗革兰氏阴性菌感染的药 7 CN 111603563 A 说 明 书 6/18 页 物组合物，该组合物可以用于治疗革兰氏阴性菌引起的感染。 通过如下试验说明本发明所述药物组合物的有益效果。 试验一：药物组合物体内抑菌试验菌液：用5％的酵母培养液稀释铜绿假单胞菌， 肺炎克雷伯杆菌混悬液， 受试动物：健康昆明种小鼠，SPF级，4-8周龄，体重18-22g。雌雄各半，随机分组，每组分 为对照组，实验组低，中，高剂量，每个剂量组20只。 感染菌株最小致死量(MLD)的测定： 取健康昆明种小鼠，SPF级，随机分组，每组5只，雌雄兼用，吸取用5％的酵母培养液稀 释配制的不同稀释度的菌液分别腹腔注射，给药体积为0.5mL/只，感染后观察并记录24h内 小鼠死亡数，以引起小鼠100％死亡的最低剂量作为MLD，以MLD作为感染小鼠体内保护试验 的感染剂量。 经测定，所用两种菌液，MLD值如下：铜绿假单胞菌，7.5×107cfu，肺炎克雷伯杆 菌：1.0×109cfu。 药物剂量选择： 对于给予的抗生素，则根据人用剂量，按体重折算成小鼠给药剂量，给药。对于抗生素 和苦柯胺B甲磺酸盐的联合给药，在抗生素给药剂量的基础上加载苦柯胺B甲磺酸盐，剂量 分为高，中，低三个剂量组。 抗生素加载苦柯胺B甲磺酸盐对铜绿假单胞菌感染小鼠模型的保护作用： 取小鼠600只，全为雄性，按体重随机分为30组，每组20只，按下表分组，并按相应剂量 给药。模型对照组给予0.9％氯化钠注射液0.5ml。 先以7.5×107cfu的铜绿假单胞菌感染小鼠，腹腔注射，0.5mL/只，感染后立即尾 静脉注射的相应剂量的药物。给药后连续观察7天，记录小鼠的死亡情况，如下表所示： 8 CN 111603563 A 说 明 书 7/18 页 。 说明：上表中给药剂量折算，假定成人体重60kg。 从上述试验结果可以看出，当给予一定量抗生素后，小鼠死亡数明显降低，当在抗 生素基础上加载苦柯胺B甲磺酸盐后，小鼠死亡数进一步降低，并且随着加载苦柯胺B甲磺 酸盐剂量的增加而进一步降低。 说明苦柯胺B甲磺酸盐和抗生素的组合物对铜绿假单胞菌感染的小鼠具有明显的 保护作用，并且强于单独应用抗生素或苦柯胺B甲磺酸盐。 9 CN 111603563 A 说 明 书 8/18 页 抗生素加载苦柯胺B甲磺酸盐对肺炎克雷伯杆菌感染小鼠模型的保护作用取小鼠 1000只，雌雄各半，按体重随机分为50组，每组20只，按下表分组，并按相应剂量给药，先以 1.0×109cfu的对肺炎克雷伯杆菌感染小鼠，腹腔注射，0.5mL/只，感染后立即尾静脉注射 的相应剂量的药物，按如下表格剂量给药，模型对照组给予0.9％氯化钠注射液0.5ml。给药 后连续观察7天，记录小鼠死亡情况。 10 CN 111603563 A 说 明 书 9/18 页 从上述试验结果可以看出，当给予一定量抗生素后，小鼠死亡数明显降低，当在抗 11 CN 111603563 A 说 明 书 10/18 页 生素基础上加载苦柯胺B甲磺酸盐后，小鼠死亡数进一步降低，并且随着加载苦柯胺B甲磺 酸盐剂量的增加而进一步降低。 说明苦柯胺B甲磺酸盐和抗生素的组合物对肺炎克雷伯菌感染的小鼠具有明显的 保护作用，并且强于单独应用抗生素或苦柯胺B甲磺酸盐。 实验二：药物组合物12个月稳定性实验取实施例1-3制备的39个处方样品(含包 装，西林瓶 铝塑组合盖)，及对应规格市售品13种各个抗生素品种(含包装，生产企业见表 格)52组样品分别编号001-052分别置40℃±2℃，75％±5％RH条件下存储12个月，分别于0 月，1月，3月，6月，12月，取样测定相关性质，得到相应数据，如下表所示： 表5实施例1-3样品与市售制剂样品稳定性比较 12 CN 111603563 A 说 明 书 11/18 页 13 CN 111603563 A 说 明 书 12/18 页 14 CN 111603563 A 说 明 书 13/18 页 15 CN 111603563 A 说 明 书 14/18 页 16 CN 111603563 A 说 明 书 15/18 页 17 CN 111603563 A 说 明 书 16/18 页 。 由上表数据可以看出，依本发明所述实施例1-3所述处方和工艺所制备的各种抗 菌组合物，与未加入增效剂苦柯胺B甲磺酸盐相比，其稳定性相近，未见显著降低。在40℃± 2℃，75％±5％RH加速条件下，12个月存储后，其含量，有关物质均有所变化，但是含量均超 过98.5％，最大单杂质小于0.3％，总杂质均低于1.5％。 即通过本发明的处方和工艺所制备的抗菌组合物的抗菌效力得到了显著增强，具 体表现为其对小鼠感染模型的保护作用显著优于其对应的抗生素对照组。从而使得本发明 具有突出的实质性特点和显著进步，并具有实用性。 说明：本专利申请中各种药物的数据，不计算钠离子，甲磺酸根，氯离子，具体如 下：头孢哌酮钠以头孢哌酮计；舒巴坦钠以舒巴坦计；苦柯胺B甲磺酸盐以苦柯胺B计；头孢 呋辛钠以头孢呋辛计；头孢唑肟钠以头孢唑肟计；拉氧头孢钠以拉氧头孢计；盐酸头孢替安 以头孢替安计；头孢唑林钠以头孢唑林计；头孢地嗪钠以头孢地嗪计；美洛西林钠以美洛西 林计；哌拉西林钠以哌拉西林计；西司他丁钠以西司他丁计。
本发明涉及一种革兰氏阴性菌抗菌药物组合物，由苦柯胺B和β‑内酰胺类抗生素组成，还可以进一步加入β‑内酰胺酶抑制剂从而增加组合物的抗菌活性，经动物试验证明，本发明所公开的抗菌药物组合物，比单独应用β‑内酰胺类抗生素或苦柯胺B，对试验动物的保护作用更强。 全部
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细菌大概可以分为两种：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。在革兰氏测试中，向细菌 培养皿中加入一种紫色染料，如果细菌变为紫色，则称革兰氏阳性菌，而革兰氏阴性菌只会 变为红色或粉红色。革兰氏阴性菌往往比阳性菌更具有耐药性，因为它们有更坚固的细胞 壁。MRSA(抗甲氧西林金黄色葡萄球菌)感染和痤疮都是由于革兰氏阳性菌，莱姆病和肺炎 的罪魁祸首则是革兰氏阳性菌。 革兰氏阴性菌的病原能力通常与其细胞壁组成相关，具体说来有脂多糖 (lipopoly-saccharide)，又称为LPS或者内毒素(endotoxin)层。 内毒素为革兰氏阴性菌(如伤寒杆菌，结核杆菌，痢疾杆菌等)的菌体中存在的毒 性物质的总称。是多种革兰氏阴性菌的细胞壁成分，由菌体裂解后释出的毒素，又称之为 “热原”。单位Eu/ml。其化学成分有磷脂多糖-蛋白质复合物，其毒性成分主要为类脂质A。内 毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的黏肽上。 各种细菌的内毒素的毒性作用大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及 弥漫性血管内凝血等。内毒素耐热而稳定，抗原性弱。可刺激机体产生抗体，但无中和作用， 形成抗毒素，经甲醛处理不能成为类毒素。 内毒素脂多糖分子由菌体特异性多糖、非特异性核心多糖和脂质A三部分构成。脂 质A是内毒素的主要毒性组分。不同革兰氏阴性细菌的脂质A结构基本相似。因此，凡是由革 兰氏阴性菌引起的感染，虽菌种不一，其内毒素导致的毒性效应大致类同。这些毒性反应主 要有。 发热反应。人体对细菌内毒素极为敏感。极微量(1-5纳克/公斤体重)内毒素就能 引起体温上升，发热反应持续约4小时后逐渐消退。自然感染时，因革兰氏阴性菌不断生长 繁殖，同时伴有陆续死亡、释出内毒素，故发热反应将持续至体内病原菌完全消灭为止。内 毒素引起发热反应的原因是内毒素作用于体内的巨噬细胞等，使之产生白细胞介素1、6和 肿瘤坏死因子α等细胞因子，这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢，促使体温升 高发热。 白细胞反应。细菌内毒素进入宿主体内以后，血流中占白细胞总数60％-70％的中 性粒细胞数量迅速减少，这是因为细胞发生移动并粘附到组织毛细血管上。不过1-2小时 后，由内毒素诱生的中性细胞释放因子刺激骨髓释放其中的中性粒细胞进入血流，使其数 量显著增加，有部分不成熟的中性粒细胞也被释放出来。由于绝大多数被革兰氏阴性菌感 染的患者血流中白细胞总数都会增加，所以现在医生在诊断前，为了初步区别是细菌性感 染还是病毒性感染，常常要化验病人的血液，对白细胞进行总数测定和分类计数。被病毒感 染的病人，其白细胞总数和中性粒细胞百分比基本在正常值范围内。 3 CN 111603563 A 说 明 书 2/18 页 内毒素血症与内毒素休克。当病灶或血流中革兰氏阴性病原菌大量死亡，释放出 来的大量内毒素进入血液时，可发生内毒素血症。大量内毒素作用于机体的巨噬细胞、中性 粒细胞、内皮细胞、血小板，以及补体系统和凝血系统等，便会产生白细胞介素1、6、8和肿瘤 坏死因子α、组胺、5-羟色胺、前列腺素、激肽等生物活性物质。这些物质作用于毛细血管造 成功能紊乱而导致微循环障碍，临床表现为微循环衰竭、低血压、缺氧、酸中毒等，于是导致 病人休克，这种病理反应叫做内毒素休克。 关于内毒素休克，过去曾有过惨痛的教训。20世纪40年代青霉素刚问世的时候，医 生发现青霉素对脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑膜炎疗效非常显著。因此，凡发现这类病人， 一律优选青霉素进行治疗；且按照一般规律，用药剂量随病情严重程度而递增。结果发生了 意外，用大剂量青霉素治疗重症脑膜炎患者时，不少病人发生内毒素休克而死亡。后来经过 研究分析，发现了其中的原委。病情严重的患者，体内存在的病原菌数量多，医生采用大剂 量“轰炸”，意欲“一举歼敌”。快速、彻底杀灭病原体，这种战略无可非议，但有些医生忽略了 另一方面，即流行性脑膜炎的病原菌是属革兰氏阴性菌的脑膜炎奈瑟菌，其致病物质是内 毒素，而内毒素是要在病菌死亡后再放出的。如今用大剂量青霉素一下子将全部病菌杀死， 也就是使大量内毒素一次放出，促成了内毒素休克，加速了患者的死亡。随着医学的进步， 现在医生遇到这类病人，一方面仍然要用大剂量的有效抗菌药物去对付，同时要加用激素 类药物，以保护对内毒素敏感的细胞不对内毒素诱生的细胞因子发生反应，从而度过“休 克”难关。犹如外科手术时，采用麻醉药使病人丧失痛觉一样。 可以说由于革兰氏阴性细菌感染引起的各种症状，其主要致病因素就是内毒素。 革兰氏阴性菌，以大肠杆菌为代表。除了大肠杆菌外，变形杆菌、铜绿假单胞菌、痢 疾杆菌、肺炎克雷伯杆菌、布氏杆菌、流感(嗜血)杆菌、副流感(嗜血)杆菌、卡他(摩拉)菌、 不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、 霍乱弧菌、副溶血性杆菌、类志贺吡邻单胞菌等也是革兰氏阴性菌。可见，革兰氏阴性菌以 杆菌最为常见。 革兰阴性菌感染，常见有脑膜炎球菌，痢疾、伤寒、副伤寒、沙门、肉毒杆菌等，与医 院内感染中常见的肠、肺炎克雷伯菌、变形、铜绿假单胞菌以及其他少见的军团病菌和淋球 菌等。其引起的常见疾病如流行性脑脊液髓膜炎、淋病，细菌性痢疾、霍乱、伤寒与副伤寒， 甚至败血症从而威胁生命。 β-内酰胺类抗生素(Beta-lactam antibiotic)是一种种类很广的抗生素，其中包 括青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类、碳青霉烯和青霉烯类酶抑制剂等。基本上所 有在其分子结构中包括β-内酰胺核的抗生素均属于β-内酰胺类抗生素。它是现有的抗生素 中使用最广泛的一类。 β-内酰胺类抗生素是一种杀菌剂，它抑制细菌细胞壁中肽聚糖的形成。肽聚糖影 响细菌的细胞壁很大、尤其在革兰氏阳性菌细胞壁的结构强度。肽聚糖合成的最后一步被 称为青霉素结合蛋白的转肽酶形成。 由于抗生素的大量应用，细菌本身产生β-内酰胺酶，用于水解掉β-内酰胺类抗生 素，从而使其失去杀菌效力，故抗生素中常加入β-内酰胺酶抑制剂，用以增加抗生素的杀菌 效力。 目前常用β-内酰胺酶抑制剂，例如克拉维酸，舒巴坦，他唑巴坦等，作为β-内酰胺 4 CN 111603563 A 说 明 书 3/18 页 类抗生素的抗菌增效剂。用于抑制细菌产生β-内酰胺酶的能力，进一步杀死细菌。 目前的细菌感染治疗，其治疗方法均为杀死细菌，之后靠人体自身将细菌死亡所 产生的有毒物质(例如，内毒素)代谢掉。 并没有针对细菌死后所产生的内毒素的控制方法。更没有抗生素与内毒素控制联 用的治疗方式或药物组合。 地骨皮为茄科植物枸杞(Lycium chinense Mill.)或宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)的干燥根皮。在传统中医药理论中，地骨皮具有清热解毒功效。现代药理研究发现，地骨 皮主要含有生物碱类、有机酸类、蒽醌类和肽类成分，发挥降血压、降血糖、解热和镇痛等药 理作用。 苦柯胺B，是从中药地骨皮中提取得到的生物碱，有报道显示其具有多种药理活 性。 其化学结构如下： 中国专利201410403053.8，公开了包括地骨皮甲素(kukoamine A)和地骨皮乙素 (kukoamine B)中至少一种的组合物及其在改善骨健康以及治疗和/或预防骨疾病方法中 的用途。其作用机制为增加了碱性磷酸酶活性。 中国专利201010156503.X公开了苦柯胺A和苦柯胺B用于制备预防和治疗脓毒症 及自身免疫性疾病药物的用途。本发明以诱发脓毒症及自身免疫性疾病的主要病原分子细 菌内毒素(LPS)和细菌非甲基化DNA(CpG DNA)为靶点，从中药中定向分离药物先导化合物， 克服了现有中药组分和提取物物质基础和作用靶点不明的主要缺陷，研制一种安全、有效、 质量可控的新药物，以解决目前脓毒症及自身免疫性疾病缺乏有效治疗药物的问题。 中国专利201611040096.X，公开了地骨皮乙素(苦柯胺B)在制备治疗Ⅱ型糖尿病 药物中的应用。地骨皮乙素通过抑制二肽基肽酶4(DPP-4)活性，进而发挥降血糖的作用，因 此可将其应用于制备治疗糖尿病的药物中。本发明还提供了一种包括作为有效成分的地骨 皮乙素和药剂学上接受的药物赋形剂或载体的药物组合物，以地骨皮乙素为有效成分的药 物组合物可有效改善胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗水平，为糖尿病的防治提供新的药物选 择。 中国专利201310522480.3，公开了地骨皮醇提物及已获得的地骨皮甲素和地骨皮 乙素具有神经元修复及保护的新用途。其特征是地骨皮醇提物、地骨皮甲素及地骨皮乙素 可以作为治疗神经退行性疾病、创伤性脑损伤、中风中药物的应用。本发明的目的就是发掘 了具有咖啡酰胺结构及类咖啡酰胺结构的生物碱的神经保护前景，开拓了一个新的药用领 域。 5 CN 111603563 A 说 明 书 4/18 页
技术实现要素：
针对现有技术的不足，发明人经过研究，将β-内酰胺类抗生素与苦柯胺B按一定比 例制备成组合物，用于革兰氏阴性菌感染所致疾病，在杀灭细菌的同时，抑制其死亡后释放 的细菌内毒素引起的各种生理反应，例如常见的发热，白细胞升高，菌血症等等。 本发明所述药物组合物由苦柯胺B和β-内酰胺类抗生素组成，其特征在于，所述β- 内酰胺类抗生素为头孢菌素或青霉素类或碳青霉烯抗生素的一种。 所述苦柯胺B，为苦柯胺B的甲磺酸盐。 所述头孢菌素选自头孢哌酮钠，头孢他啶，头孢呋辛钠，头孢唑肟钠，拉氧头孢钠， 盐酸头孢替安，头孢唑林钠，头孢地嗪钠中的一种。 所述青霉素类抗生素选自哌拉西林钠，美洛西林钠中的一种。 所述碳青霉烯类抗生素选自美罗培南，亚胺培南中的一种。 所述药物组合物可以进一步加入β-内酰胺酶抑制剂，用于进一步增强疗效。 所述β-内酰胺酶抑制剂为克拉维酸钾，舒巴坦钠，他唑巴坦钠，西司他丁钠中的一 种。 所述药物组合物为注射用无菌粉末。 所述药物组合物中头孢菌素与苦柯胺B的质量比为2000：1-50:1。 所述药物组合物中青霉素类抗生素与苦柯胺B的质量比为3000:1-300:1。 药物组合物中碳青霉烯类抗生素与苦柯胺B的质量比为400:1-40:1。 据现有技术文献记载，上述头孢菌素，青霉素类，碳青霉烯类抗生素的抗菌谱如 下。 注射用美洛西林钠(1g)： 对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎杆菌、变形杆菌、肠杆菌属、枸橼酸杆菌、沙雷菌属、 不动杆菌属以及对青霉素敏感的革兰阳性球菌均有抑菌作用。 注射用头孢哌酮钠(1g)： 对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌属、伤寒沙门菌、志贺菌属、枸橼酸杆菌属等肠 杆菌科细菌和铜绿假单胞菌有良好抗菌作用。 注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠(2g，1:1)： 对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌属、变形杆菌属、伤寒沙门菌、志贺菌属、枸橼酸杆菌属等 肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌有良好抗菌作用。 注射用头孢他啶(1g)： 对铜绿假单胞菌等假单胞菌属、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌属、吲哚阳性及阴性变形杆 菌、普鲁威登菌、沙门菌属、沙雷菌属和志贺菌属等以及小肠结肠炎耶尔森菌等革兰阴性杆 菌具高度抗菌活性。 注射用哌拉西林钠(1g)： 对大肠埃希菌、变形杆菌属、沙雷菌属、肺炎克雷伯菌属、肠杆菌属、枸橼酸菌属、沙门 菌属和志贺菌属等肠杆菌科细菌，以及铜绿假单胞菌、不动杆菌属、流感嗜血杆菌、奈瑟菌 属等其他革兰阴性菌均具有良好抗菌作用。 注射用美罗培南(1g)： 对大肠杆菌、流感嗜血杆菌(β-内酰胺酶阳性菌株及β-内酰胺酶阴性菌株)、肺炎克雷 6 CN 111603563 A 说 明 书 5/18 页 伯菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟菌均具有良好抗菌作用。 注射用亚胺培南西司他丁钠(2g，1:1): 对革兰氏阴性需氧菌抗菌范围包括：无色杆菌属，不动杆菌属(以前称小小赫尔菌属)， 嗜水气单胞菌，产碱杆菌属，支气管博代氏杆菌，支气管败血症博代氏杆菌，博代百日咳杆 菌，马耳他布鲁氏杆菌，类鼻疽伯克霍尔德菌(以前称类鼻疽假单胞菌)，施氏伯克霍尔德菌 (以前称施氏假单细胞菌)，弯曲杆菌属，嗜二氧化碳噬细胞菌属，柠檬酸细菌属，弗氏柠檬 酸菌，克氏柠檬酸菌(以前称多样性柠檬酸菌)，分外埃肯杆菌族，肠杆菌属，产气杆菌，聚团 肠杆菌，阴沟肠杆菌，大肠杆菌，阴道加德诺菌属，杜克嗜血杆菌，流感嗜血杆菌(包括产β- 内酰胺酶菌株)，副流感嗜血杆菌，蜂房哈夫尼菌，克雷白氏杆菌属，奥克西托克雷白氏杆 菌，臭鼻肺炎克雷伯菌，肺炎杆菌，莫拉菌属，摩氏摩根菌(以前称摩氏变形菌)，淋病奈瑟球 菌(包括产生青霉素酶菌株)，脑膜炎奈瑟氏球菌，巴斯德菌属，多杀巴氏杆菌，类志贺邻单 胞菌，变形杆菌属，奇异变形杆菌，普通变形杆菌，普罗威登斯菌属，产碱普罗威登斯菌属， 雷氏普罗威登斯菌(以前称雷氏变形菌)，斯氏普罗威登斯菌，假单胞菌属，铜绿假单胞菌， 萤光假单胞菌，恶臭假单胞菌，沙门氏菌属，伤寒沙门氏菌，沙雷氏菌属，变斑沙雷氏菌(以 前称液化沙雷氏菌)，粘质沙雷氏菌，志贺氏菌属，涅尔森氏菌属(以前称巴斯德杆菌)，小肠 结肠炎涅尔森氏菌，假结核涅尔森氏菌均具有良好抗菌作用。 注射用头孢呋辛钠(1.5g)： 对大肠埃希菌、流感杆菌(包括产β-内酰胺酶菌)、副流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、卡 他莫拉菌(包括产β-内酰胺酶菌)、淋病奈瑟菌(包括产β-内酰胺酶菌)均具有良好抗菌作 用。 注射用头孢唑肟钠(1g)： 对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌等肠杆菌科细菌有强大抗菌作用。 注射用拉氧头孢钠(1g)： 对大肠杆菌、流感杆菌、肺炎克雷伯菌、各型变形杆菌、肠杆菌属、枸橼酸杆菌、沙雷杆 菌等对该品高度敏感。对厌氧菌有良好的抗菌作用。 注射用盐酸头孢替安(1g)： 对葡萄球菌属、链球菌属(场球菌除外)、肺炎球菌、流感杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌 属、肠道菌属、枸橼酸杆菌属、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、雷特格式变形杆菌、摩根氏变 形杆菌等均具有良好抗菌作用。 注射用头孢唑林钠(1g)： 对葡萄球菌(包括产酶菌株)、链球菌(肠球菌除外)、肺炎链球菌、大肠杆菌、奇异变形 杆菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌以及产气肠杆菌等有抗菌作用。 注射用头孢地嗪钠(1g)： 对金黄色葡萄菌(耐新青酶菌株例外)、肺炎链球菌、链球菌属、奈瑟氏淋球菌(包括产 生青霉素酶的菌株)、奈瑟氏脑膜炎双球菌、卡它氏Branhamlla菌、大肠杆菌、志贺氏菌属、 沙门氏菌属、柠檬酸细菌属、肺炎克雷伯菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、普罗维登斯菌、 莫尔加民氏摩根氏杆菌、流感嗜血杆菌及棒状杆菌均具有良好抗菌作用。 通过如下实验进一步说明本发明专利申请。 针对现有技术的不足，发明人通过研究，得到一种用于抗革兰氏阴性菌感染的药 7 CN 111603563 A 说 明 书 6/18 页 物组合物，该组合物可以用于治疗革兰氏阴性菌引起的感染。 通过如下试验说明本发明所述药物组合物的有益效果。 试验一：药物组合物体内抑菌试验菌液：用5％的酵母培养液稀释铜绿假单胞菌， 肺炎克雷伯杆菌混悬液， 受试动物：健康昆明种小鼠，SPF级，4-8周龄，体重18-22g。雌雄各半，随机分组，每组分 为对照组，实验组低，中，高剂量，每个剂量组20只。 感染菌株最小致死量(MLD)的测定： 取健康昆明种小鼠，SPF级，随机分组，每组5只，雌雄兼用，吸取用5％的酵母培养液稀 释配制的不同稀释度的菌液分别腹腔注射，给药体积为0.5mL/只，感染后观察并记录24h内 小鼠死亡数，以引起小鼠100％死亡的最低剂量作为MLD，以MLD作为感染小鼠体内保护试验 的感染剂量。 经测定，所用两种菌液，MLD值如下：铜绿假单胞菌，7.5×107cfu，肺炎克雷伯杆 菌：1.0×109cfu。 药物剂量选择： 对于给予的抗生素，则根据人用剂量，按体重折算成小鼠给药剂量，给药。对于抗生素 和苦柯胺B甲磺酸盐的联合给药，在抗生素给药剂量的基础上加载苦柯胺B甲磺酸盐，剂量 分为高，中，低三个剂量组。 抗生素加载苦柯胺B甲磺酸盐对铜绿假单胞菌感染小鼠模型的保护作用： 取小鼠600只，全为雄性，按体重随机分为30组，每组20只，按下表分组，并按相应剂量 给药。模型对照组给予0.9％氯化钠注射液0.5ml。 先以7.5×107cfu的铜绿假单胞菌感染小鼠，腹腔注射，0.5mL/只，感染后立即尾 静脉注射的相应剂量的药物。给药后连续观察7天，记录小鼠的死亡情况，如下表所示： 8 CN 111603563 A 说 明 书 7/18 页 。 说明：上表中给药剂量折算，假定成人体重60kg。 从上述试验结果可以看出，当给予一定量抗生素后，小鼠死亡数明显降低，当在抗 生素基础上加载苦柯胺B甲磺酸盐后，小鼠死亡数进一步降低，并且随着加载苦柯胺B甲磺 酸盐剂量的增加而进一步降低。 说明苦柯胺B甲磺酸盐和抗生素的组合物对铜绿假单胞菌感染的小鼠具有明显的 保护作用，并且强于单独应用抗生素或苦柯胺B甲磺酸盐。 9 CN 111603563 A 说 明 书 8/18 页 抗生素加载苦柯胺B甲磺酸盐对肺炎克雷伯杆菌感染小鼠模型的保护作用取小鼠 1000只，雌雄各半，按体重随机分为50组，每组20只，按下表分组，并按相应剂量给药，先以 1.0×109cfu的对肺炎克雷伯杆菌感染小鼠，腹腔注射，0.5mL/只，感染后立即尾静脉注射 的相应剂量的药物，按如下表格剂量给药，模型对照组给予0.9％氯化钠注射液0.5ml。给药 后连续观察7天，记录小鼠死亡情况。 10 CN 111603563 A 说 明 书 9/18 页 从上述试验结果可以看出，当给予一定量抗生素后，小鼠死亡数明显降低，当在抗 11 CN 111603563 A 说 明 书 10/18 页 生素基础上加载苦柯胺B甲磺酸盐后，小鼠死亡数进一步降低，并且随着加载苦柯胺B甲磺 酸盐剂量的增加而进一步降低。 说明苦柯胺B甲磺酸盐和抗生素的组合物对肺炎克雷伯菌感染的小鼠具有明显的 保护作用，并且强于单独应用抗生素或苦柯胺B甲磺酸盐。 实验二：药物组合物12个月稳定性实验取实施例1-3制备的39个处方样品(含包 装，西林瓶 铝塑组合盖)，及对应规格市售品13种各个抗生素品种(含包装，生产企业见表 格)52组样品分别编号001-052分别置40℃±2℃，75％±5％RH条件下存储12个月，分别于0 月，1月，3月，6月，12月，取样测定相关性质，得到相应数据，如下表所示： 表5实施例1-3样品与市售制剂样品稳定性比较 12 CN 111603563 A 说 明 书 11/18 页 13 CN 111603563 A 说 明 书 12/18 页 14 CN 111603563 A 说 明 书 13/18 页 15 CN 111603563 A 说 明 书 14/18 页 16 CN 111603563 A 说 明 书 15/18 页 17 CN 111603563 A 说 明 书 16/18 页 。 由上表数据可以看出，依本发明所述实施例1-3所述处方和工艺所制备的各种抗 菌组合物，与未加入增效剂苦柯胺B甲磺酸盐相比，其稳定性相近，未见显著降低。在40℃± 2℃，75％±5％RH加速条件下，12个月存储后，其含量，有关物质均有所变化，但是含量均超 过98.5％，最大单杂质小于0.3％，总杂质均低于1.5％。 即通过本发明的处方和工艺所制备的抗菌组合物的抗菌效力得到了显著增强，具 体表现为其对小鼠感染模型的保护作用显著优于其对应的抗生素对照组。从而使得本发明 具有突出的实质性特点和显著进步，并具有实用性。 说明：本专利申请中各种药物的数据，不计算钠离子，甲磺酸根，氯离子，具体如 下：头孢哌酮钠以头孢哌酮计；舒巴坦钠以舒巴坦计；苦柯胺B甲磺酸盐以苦柯胺B计；头孢 呋辛钠以头孢呋辛计；头孢唑肟钠以头孢唑肟计；拉氧头孢钠以拉氧头孢计；盐酸头孢替安 以头孢替安计；头孢唑林钠以头孢唑林计；头孢地嗪钠以头孢地嗪计；美洛西林钠以美洛西 林计；哌拉西林钠以哌拉西林计；西司他丁钠以西司他丁计。
