技术摘要：
本发明公开负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用，以及Survivin双抑制剂联合用药在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述双抑制剂包括小分子抑制剂YM155和蛋白抑制剂TmSm。本发明得到的纳米粒呈纳米笼球形结构，无粘连，粒径小，范围窄，便于静脉注射，靶  全部
背景技术：
癌症是世界范围内的主要公共卫生问题，化疗、放疗和手术是当前癌症治疗的关 键方法。然而，常规化学疗法由于不能特异性杀死肿瘤细胞而常常在癌症治疗中伴有严重 的副作用。此外，癌症的耐药性的发展导致癌症的单药疗法不能取得满意结果。因此，联合 疗法已经成为一种新颖的癌症治疗方法，它通过潜在的协同作用来增强抗癌效果。常见的 联合治疗策略包括化疗药物、抗癌金属、基因药物和治疗蛋白药物。由于两种抗癌策略对同 一靶点或者不同靶点的多重作用具有潜在的协同抗癌作用，治疗蛋白药物和化疗药物的联 合应用在近期的实验研究和临床评价中受到了相当的重视。与化疗药物和抗癌金属相比， 蛋白药物具有特异性强、低毒性和功能明确。同时，它也不存在基因药物的高免疫原性和遗 传风险。尽管通过联合应用蛋白和化疗药物获得了令人鼓舞的实验和临床结果，但常规联 用方法存在的缺陷却极大限制了两种抗癌药物的治疗潜力和临床应用。主要的缺陷之一是 游离药物的短半衰期和化疗药物的系统毒性。另一个复杂性在于蛋白和化疗药物的不同的 体内药代动力学分布，这将导致两种药物不能被大量富集在肿瘤部位并丧失协同抗癌作 用。为了获得最佳的协同抗癌作用，需要开发可以解决以上关键问题的新策略。 近年来，各种基于合成材料(凝胶、聚合物、二氧化硅)和天然材料(脂质、寡糖、蛋 白质)的药物递送系统已被设计用于共同递送蛋白和化疗药物。尽管这些递送系统可以改 变药物的药代动力学并改善治疗效果，但是它们共同递送蛋白和化疗药物的能力仍然不能 令人满意。值得注意的是，铁蛋白是包括人在内的真核生物中主要的铁转运和存储蛋白，由 铁蛋白重链和轻链的24个亚基组成。不同于天然存在的铁蛋白，铁蛋白重链纳米颗粒 (FTH1NPs)是由  24个亚基组装形成球形纳米笼，内径和外径分别约为8nm和12nm。FTH1NPs  的化学或基因工程修饰能够有效递送各种治疗蛋白药物和成像剂，包括细胞毒性肽、流感 病毒HA和eGFP。同时，FTH1NPs的中空内腔不仅作为金属的天然运输载体，而且可以包裹多 种化疗药物，如阿霉素、姜黄素和顺铂。重要的是，Li等发现FTH1NPs能被转铁蛋白受体1 (TfR1)特异性识别，该蛋白在肿瘤细胞表面过表达，并促进NPs的细胞摄取。另一项研究表 明，FTH1NPs可以将碘化丙啶直接递送至细胞核。因此，FTH1NPs是一种可以有效地共同加载 蛋白和化疗药物的递送载体，并具有良好的生物相容性和生物降解性。 Survivin，凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成员之一，是肿瘤治疗的重要靶标，它能够 抑制细胞凋亡、调节细胞有丝分裂以及与肿瘤细胞多药耐药密切相关。它在大多数正常成 人组织中检测不到，而在大多数癌细胞中过表达，例如肺癌和胰腺癌。YM155是一种新型的 Survivin小分子抑制剂，能与Survivin启动子  Sp1结合，并阻止癌细胞中Survivin的转录。 在最近完成的I/II期临床试验中，  YM155在晚期非小细胞肺癌患者中表现出令人鼓舞的抗 3 CN 111544598 A 说　明　书 2/16 页 癌作用，但不幸的是，其临床应用存在两种缺点。一种重要的缺陷是由高剂量YM155的非特 异性细胞摄取引起的系统毒性。另一方面，虽然YM155能在Survivin的转录水平进行抑制， 但是却不能有效抑制肿瘤细胞中已周转的Survivin蛋白。因此，一种有效的药物被迫切需 求与YM155联合应用，它能抑制肿瘤细胞中Survivin的蛋白含量和降低YM155的使用剂量。 显性负突变体是一种因结构变化而失去正常的生物学功能的蛋白质，它可竞争性地抑制其 相应的野生型蛋白而阻断野生型蛋白的生物学功能。显性负突变Survivin是利用非功能性 蛋白质与野生型  Survivin竞争，从而抑制其功能。在我们之前的研究中，细胞可渗透的显 性阴性TATm-Survivin(T34A)蛋白(TmSm)可以诱导包括乳腺癌Bcap-37、胰腺癌  SW1990和 肝癌SMMC-7721多种癌细胞的细胞凋亡，并能抑制Bcap-37荷瘤裸鼠中肿瘤组织的生长。然 而，TmSm蛋白的非特异性细胞渗透抑制了高度表达Survivin的某些生理细胞的增殖，包括T 淋巴细胞、造血细胞和血管内皮细胞。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供Survivin双抑制剂联合用药在制备治疗肿瘤药物 中的应用，通过蛋白抑制剂TmSm和小分子抑制剂YM155协同作用来增强抗癌效果。 本发明的第二个目的在于提供一种含有Survivin双抑制剂的药物。 本发明的第三个目的在于提供一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒，共 同负载TmSm和YM155的多功能铁蛋白纳米颗粒通过主动靶向和核靶向直接靶向癌细胞核， 可在细胞核中释放YM155，抑制Survivin的转录水平，实现Survivin转录和蛋白水平的协同 抑制并取得强大的抗肿瘤功效。 本发明的第四个目的在于提供一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒的 制备方法。本发明制备得到的纳米粒呈纳米笼球形结构，无粘连，粒径小，范围窄，便于静脉 注射，靶向效果好，该纳米粒能被癌细胞分泌的MMP-2有效切割而释放TmSm蛋白，并经由癌 细胞表面的TfR1主动靶向癌细胞，并在细胞核中释放YM155。 本发明的第五个目的在于提供一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒在 制备治疗肿瘤药物中的应用。 为实现上述第一个目的，本发明公开以下技术方案：Survivin双抑制剂联合用药 在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述双抑制剂包括小分子抑制剂YM155  和蛋白抑制剂 TmSm。 作为一个优选方案，所述肿瘤为Survivin过表达的肿瘤，包括肺癌、胰腺癌、肝癌、 乳腺癌以及膀胱癌。这些肿瘤细胞中的Survivin高表达，所以小分子抑制剂YM155和蛋白抑 制剂TmSm能够抑制Survivin转录和蛋白水平，以促进肿瘤细胞凋亡。 为实现上述第二个目的，本发明公开以下技术方案：一种含有Survivin双抑制剂 的药物，所述药物包括小分子抑制剂YM155、蛋白抑制剂TmSm以及药学上可接受的载体。 作为一个优选方案，所述药学上可接受的载体包括铁蛋白纳米颗粒铁蛋白纳米颗 粒、脂质体、PEG-PLGA纳米颗粒、碳纳米管和无机纳米颗粒。这些载体均能用于小分子药物 和蛋白药物的包封，纳米级尺寸的载体能够通过肿瘤血管漏洞(100-780nm)实现在肿瘤部 位的聚集。 为实现上述第三个目的，本发明公开以下技术方案：一种负载Survivin双抑制剂 4 CN 111544598 A 说　明　书 3/16 页 的铁蛋白纳米颗粒，所述双抑制剂包括小分子抑制剂YM155和蛋白抑制剂TmSm，以人铁蛋白 重链亚基FTH1作为蛋白载体，TmSm通过基因工程的手段串联融合到FTH1单体的C端，YM155 包裹于纳米颗粒的中空内腔。 为实现上述第四个目的，本发明公开以下技术方案：一种负载Survivin双抑制剂 的铁蛋白纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤： (1)以人铁蛋白重链亚基FTH1作为蛋白载体，选取MMP-2敏感肽作为酶切割识别位 点，选取柔性肽(G4S)2作为连接肽，利用重叠延伸PCR的方法融合成重组基因FTH1-Linker- MMP2-TmSm(FTS)； (2)取适量步骤(1)制备的FTS蛋白包涵体溶解液，将YM155储备液加入蛋白溶液 中，FTS纳米颗粒与YM155摩尔比为1：10-1：200，混合物在  2-8℃搅拌30-120min； (3)将混合液放入预处理的透析袋中，按照1：10的体积逐级放入4mol/L  尿素的透 析液A、2mol/L尿素的透析液B、1mol/L尿素的透析液C和0mol/L  尿素的透析液D中； (4)透析结束后，透析溶液在2-8℃，10,000-14 ,000rpm离心10-30min，收集上清 液，超滤管浓缩，滤膜无菌过滤。 作为一个优选方案，步骤(1)混合物在4℃搅拌60min。 作为一个优选方案，步骤(1)FTS纳米颗粒与YM155摩尔比为1：200。 作为一个优选方案，步骤(4)透析溶液在4℃，12,000rpm离心20min。 为实现上述第五个目的，本发明公开以下技术方案：一种负载Survivin双抑制剂 的铁蛋白纳米颗粒在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为Survivin  过表达的肿瘤，包 括肺癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌以及膀胱癌。 作为一个优选方案，当肿瘤是肺癌和胰腺癌时，有效剂量为  0 .05-0 .35μmol/L  FTS/YM155NPs。 制备获得的纳米粒粒径为31.0±3.4nm，包封率为19.34±1.21％，载药量为  0.08 ±0 .04％。当荷瘤裸鼠模型是肺癌时，尾静脉注射纳米粒的有效肿瘤富集时间为24h，在 10.81mg/kg纳米粒剂量下治疗15天的肿瘤抑制率达到  89.05±5.14％。 FTS/YM155NPs对癌细胞中的Survivin具有协同抑制，从而实现更强的促凋亡作 用。其中，TmSm通过遗传修饰与FTH1单体的C端融合。同时，在FTH1和TmSm之间插入MMP-2敏 感肽。这一敏感肽可以被肿瘤微环境富含的MMP-2识别切割，并原位释放促进细胞凋亡的 TmSm，从而避免TmSm对过表达Survivin的正常细胞的毒副作用。此外，载YM155的FTH1纳米 笼通过主动靶向和核靶向直接靶向癌细胞核，可在细胞核中释放YM155，抑制  Survivin的 转录水平。 本发明的优点在于，载Survivin双重抑制剂的FTH1纳米颗粒可以实现  Survivin 转录和蛋白水平的协同抑制并取得强大的抗肿瘤功效，为基于不同靶点的蛋白和化疗药物 共同递送提供了广阔的前景，这对于未来的临床应用具有重要意义。本发明的载Survivin 双重抑制剂的FTH1纳米颗粒制备方法简单，适宜大规模连续生产。 附图说明 图1为重组质粒的构建及重组蛋白的表达与纯化。其中，A：重组质粒的构建示意 图。B：重组蛋白的三维结构示意图。C：三种纯化蛋白的SDS-PAGE电泳分析。 5 CN 111544598 A 说　明　书 4/16 页 图2为装载YM155的NPs的制备和理化特性。其中，A：不同蛋白质/YM155  进料摩尔 比制备的YM155负载的纳米笼的包封效率(EE)和药物/纳米笼摩尔比。数据表示为Mean±SD (n＝3)。B：通过透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)  测量基于FTH1NPs的形态和粒径 分布。(比例尺＝50nm) 图3基于FTH1的纳米颗粒的理化表征。数据表示为Mean±SD(n＝3)。aND  表示未测 定。 图4为体外稳定性和药物释放研究。其中，A：在37℃下与PBS(pH  7.4)和  50％FBS 孵育48h后的装载YM155的NPs的稳定性评估。B：在pH  7.4和5.0 的PBS缓冲液中FTH1和FTS  NPs的体外药物释放曲线。数据表示为  Mean±SD(n＝3)。**P<0 .01，n.s .表示无显著(P> 0.05)。 图5为MMP-2催化的FTS的裂解和动力学特征。其中，A：重组蛋白FTS  和MMP-2介导 的切割位点的结构。B：Western  blot测定A549和Capan-2细胞中的MMP-2和Survivin表达水 平。C：A549和Capan-2细胞的条件培养基中分泌的MMP-2的明胶酶谱分析。D：与A549条件培 养基孵育3h和6h的FTS的  MMP-2介导的裂解测试。E：MMP-2催化的FTS裂解的动力学特征。 图6为TfR1对A549和Capan-2细胞介导的FTH1NPs的细胞摄取。其中，A：CLSM观察到 的FTS和FTH1NPs的细胞分布。红色和蓝色分别表示DOX  和Hoechst33342。B：通过流式细胞 术检测FTS和FTH1NPs的平均荧光强度。  C：在HUVEC的A549和Capan-2细胞和对照细胞上的 TfR1表达的Western印迹。D：分别在不存在或存在10倍摩尔过量的抗TfR1mAb的情况下与  FTH1/DOX和FTS/DOX  NPs孵育的A549和Capan-2细胞的荧光图像。红色和蓝色分别表示DOX 和Hoechst33342。E：FTS和FTH1NPs的平均荧光强度。数据表示为Mean±SD(n＝3)。*P<0.05， n.s.表示无显著性(P>0.05)。(比例尺＝50μm) 图7为基于FTH1的NP对A549和Capan-2细胞的细胞毒性测定。其中，  A：与FTS和 FTS/YM155NPs孵育24和48h的A549和Capan-2细胞的细胞活力。B：24和48h后，A549和Capan- 2细胞上FTS和FTS/YM155NPs的IC50值。C：与TmSm、YM155、FTH1、FTS、FTH1/YM155和FTS/ YM155NPs孵育24h和48h的A549和Capan-2细胞的细胞活力。FTS和FTS/YM155NPs的浓度保持 在0.08μmol/L，TmSm、YM155、FTH1和FTH1/YM155NPs的浓度等于FTS/YM155NPs中装载的药物 含量。数据表示为Mean±SD(n＝3)。n.s.表示无显著性(P>0.05) ,*P<0.05，**P<0.01和***P <0.001。 图8为通过流式细胞术分析A549和Capan-2细胞的凋亡。其中，A：与  TmSm、YM155、 FTH1、FTS、FTH1/YM155和FTS/YM155NPs孵育48h的  A549和Capan-2细胞的凋亡测定。FTS和 FTS/YM155NPs的浓度保持在  0.08μmol/L，TmSm、YM155、FTH1和FTH1/YM155NPs的浓度等于 FTS/YM155  NPs中装载的药物含量。B：描述凋亡细胞的总百分比的柱状图。数据表示为  Mean±SD(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。 图9为基于FTH1的纳米颗粒的生物相容性分析。其中，A：在37℃下用不同浓度的 YM155、TmSm、FTH1、FTS、FTH1/YM155、FTS/YM155NPs和FTS  NPs与YM155的混合物处理小鼠红 细胞悬液3h后的溶血率。超纯水( )和PBS(-)  分别作为阳性和阴性对照。B：溶血分析的照 片以观察上清液中是否存在溶血现象。C：主要器官和肿瘤的组织学检查。数据表示为Mean ±SD(n＝3)。(比例尺＝50μm)。 图10为基于FTH1的NPs的体内成像和抗肿瘤活性。其中，A：经皮下注射A549细胞建 6 CN 111544598 A 说　明　书 5/16 页 立A549荷瘤的Balb/c裸鼠模型。尾静脉注射载花青素的  NPs(Gallocyanine，ex/em＝740/ 830nm)，分别在0.5、4和24h成像。注射后24h，剥离裸鼠的主要器官和A549肿瘤进行离体荧 光成像。红色圆圈标记肿瘤位置。从红色到蓝色的色带代表从高到低的荧光强度。B：通过尾 静脉注射用不同药物处理的A549荷瘤裸鼠的肿瘤体积。C：治疗过程中小鼠体重的变化。D： 治疗结束后的肿瘤大小的测量。E：治疗结束后的肿瘤重量的测量。数据表示为  Mean±SD(n ＝5)。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。 图11为治疗组之间的肿瘤重量和肿瘤抑制率的比较。数据表示为  Mean±SD(n＝ 5)。aP<0.05表示与FTS  NPs、FTH1/YM155NPs和FTS  NPs YM155 组相比；bP<0.01和dP<0.05表 示与TmSm组相比；cP<0.001表示与YM155组相比。 图12为不同药物组处理的肿瘤组织的HE染色和免疫组化分析。其中，A：  HE染色观 察肿瘤组织形态，免疫组织化学分析细胞凋亡相关蛋白Survivin和  Caspase-3的表达。所 有图像均放大400倍拍摄。(比例尺＝50μm)B：通过Image  J定量分析Survivin和Caspase-3 的相对平均光密度。与生理盐水组相比，  *P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。