技术摘要：
本发明提供了提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用，该方法具体为使用物理法或者化学法对细胞进行处理；将上述提高细胞通透性的方法在制备葡萄糖二酸中应用，过程为：发酵培养表达葡醛酸脱氢酶的细胞，使用物理方法和化学表面活性剂对细胞进行通透化处理 全部
背景技术：
葡萄糖二酸被称为“最具价值的生物炼制产品”(Werpy T,Petersen G,Aden A,et al .Top valueadded chemicals from biomass ,volume 1:results ofscreening for potential candidates from sugars andsynthesis gas.Washington,DC:US Department ofEnergy,2004)，其作为一种重要的反应中间体，在生产聚合物材料、食品添加剂具有重要 的应用价值，随着研究的深入，葡萄糖二酸及其衍生物在降低胆固醇、调控人体内激素水平 等方面发挥的作用逐渐受到医学界的重视(仇钰莹,方芳,堵国成,等.葡萄糖二酸研究进展 [J].生物工程学报,2015,25(04):38-47.)。 随着人们对“绿色天然健康无公害”食品的不断推崇，国内外以化学氧化和微生物 合成方法生产葡萄糖二酸的方法产生逐渐被绿色生产的方法所取代，在绿色生产方法的研 究中，利用微生物体外发酵生产葡萄糖二酸成为了发展趋势。采用生物工程技术手段，通过 构建重组工程菌，在微生物体内过表达葡萄糖二酸生物合成核心途径中的关键酶基因，利 用表达的活性蛋白，催化底物逐步转化为葡萄糖二酸。 但是利用该重组工程菌发酵生产葡萄糖二酸的过程中存在以下2个问题：(1)重组 工程菌的葡醛酸脱氢酶虽高效表达，但由于表达的活性蛋白主要存在于胞内，与底物的接 触机会受限于细胞膜的通透性，大大降低了该重组工程菌的催化性能；(2)重组工程菌只能 使用一次，利用率低下，成本高，污染大。 基于以上现状，需要寻找一种改善细胞通透性的方式，促进底物葡萄糖醛酸向胞 内的转运，从而提高葡醛酸脱氢酶酶的利用率，进一步提高葡萄糖二酸的产量。目前国内外 还没有关于对生产葡萄糖二酸的重组菌细胞进行通透化处理的报道，因此通过物理、化学 方法，提高菌体细胞膜的通透性，促进细胞外营养物质进入细胞内或者细胞内代谢产物分 泌到胞外，克服胞内产物的抑制作用，对葡萄糖二酸的生产具有重要意义。
技术实现要素：
鉴于此，本发明提供了提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用， 该提高细胞通透性的方法具体为一种通过物理方法或化学方法对细胞进行处理的方法，使 用该方法进行细胞通透性处理，效果显著；将该方法应用于制备葡萄糖二酸中，可为生成葡 萄糖二酸的转化过程提供良好的转化环境。 本发明的技术方案如下： 一种提高细胞通透性的方法，具体为使用物理法或者化学法对细胞进行处理； 所述物理法为超声波破碎法或反复冻融法，其中，在超声波破碎法中，超声频率频 率25KHz，功率为200W，超声时间为20～100s；在反复冻融法中，反复冻融的时间为15min，次 3 CN 111593012 A 说 明 书 2/4 页 数为1～3次； 所述化学法为添加表面活性剂或添加有机溶剂作为通透剂，然后静置或慢速搅拌 悬浮液10～30min；其中，添加表面活性剂时，表面活性剂的浓度为0.1～5g/L。 优选的，在化学法中，所述表面活性剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚(曲拉通X-100) 或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)中的一种。 优选的，在化学法中，所述有机溶剂为甲苯，浓度为0.3％。 上述提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用，过程为：发酵培养 表达葡醛酸脱氢酶的细胞，使用物理方法或化学表面活性剂对细胞进行通透化处理，利用 通透化处理过的细胞来生产葡萄糖二酸。 上述提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用，步骤如下： (1)重组大肠杆菌的构建：将葡醛酸脱氢酶基因插入表达载体中，并导入宿主菌中 表达，获得重组大肠杆菌； (2)收集细胞悬液：活化步骤(1)获得的重组大肠杆菌菌株，接种到LB培养基中，37 ℃，220rpm条件下振荡培养，至OD600为0.6～1.0时，添加IPTG进行诱导并降低温度继续培养 6～18h；4℃离心收获菌泥；将菌泥用Tris-Hcl洗涤、MOPS反应液重悬后培养，获得菌泥重悬 液； (3)细胞通透性处理：将步骤(2)中菌泥重悬液进行细胞通透性处理，提高细胞通 透性；促进细胞对底物的吸收以及克服胞内产物的抑制作用； (4)添加底物：向步骤(3)中细胞通透化处理过的菌悬液中添加一定浓度的葡萄糖 醛酸，继续37℃，200rpm条件下振荡培养10h； (5)产物的测定：采用超高效液相色谱(HPLC)定量测定发酵产生的葡萄糖二酸。 进一步的，在步骤(1)中，所述葡醛酸脱氢酶来源于氨基酸序列为SEQ IDNO.1的假 单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonas synxantha strain KENGFT3)和氨基酸序列为SEQ ID NO .2的脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas fragi strain P121)；所述的表达载体为 pETDuet-1；所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌XL1-Blue或大肠杆菌Rosetta。 优选的，在步骤(2)中，所述诱导剂IPTG的添加量为0.4mM。 优选的，在步骤(2)中，所述添加IPTG之后重组大肠杆菌的培养温度为26℃、培养 时间18h。 优选的，在步骤(2)中，所述菌泥的添加量为5～10g/L；所述Tris-Hcl洗涤液的pH 为7.5，浓度为25mM；所述MOPS的pH为7.5，浓度为100mM。 与现有技术相比，本发明的有益效果： (1)本发明通过对重组工程菌进行细胞通透化处理生产葡萄糖二酸，与未进行通 透化处理的重组工程相比，葡萄糖二酸的产量有所提高。 (2)本发明通过改善工业菌株的细胞通透性来提高目标产物的发酵水平，针对性 非常强，符合工业生产菌株的育种需要，易于在其他工业微生物菌种的育种改造中推广应 用。 (3)本发明填补了国内外关于利用表面活性剂重组工程菌生产葡萄糖二酸的技术 空白，为微生物育种提供了一条全新的方法。 4 CN 111593012 A 说 明 书 3/4 页
本发明提供了提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用，该方法具体为使用物理法或者化学法对细胞进行处理；将上述提高细胞通透性的方法在制备葡萄糖二酸中应用，过程为：发酵培养表达葡醛酸脱氢酶的细胞，使用物理方法和化学表面活性剂对细胞进行通透化处理 全部
背景技术：
葡萄糖二酸被称为“最具价值的生物炼制产品”(Werpy T,Petersen G,Aden A,et al .Top valueadded chemicals from biomass ,volume 1:results ofscreening for potential candidates from sugars andsynthesis gas.Washington,DC:US Department ofEnergy,2004)，其作为一种重要的反应中间体，在生产聚合物材料、食品添加剂具有重要 的应用价值，随着研究的深入，葡萄糖二酸及其衍生物在降低胆固醇、调控人体内激素水平 等方面发挥的作用逐渐受到医学界的重视(仇钰莹,方芳,堵国成,等.葡萄糖二酸研究进展 [J].生物工程学报,2015,25(04):38-47.)。 随着人们对“绿色天然健康无公害”食品的不断推崇，国内外以化学氧化和微生物 合成方法生产葡萄糖二酸的方法产生逐渐被绿色生产的方法所取代，在绿色生产方法的研 究中，利用微生物体外发酵生产葡萄糖二酸成为了发展趋势。采用生物工程技术手段，通过 构建重组工程菌，在微生物体内过表达葡萄糖二酸生物合成核心途径中的关键酶基因，利 用表达的活性蛋白，催化底物逐步转化为葡萄糖二酸。 但是利用该重组工程菌发酵生产葡萄糖二酸的过程中存在以下2个问题：(1)重组 工程菌的葡醛酸脱氢酶虽高效表达，但由于表达的活性蛋白主要存在于胞内，与底物的接 触机会受限于细胞膜的通透性，大大降低了该重组工程菌的催化性能；(2)重组工程菌只能 使用一次，利用率低下，成本高，污染大。 基于以上现状，需要寻找一种改善细胞通透性的方式，促进底物葡萄糖醛酸向胞 内的转运，从而提高葡醛酸脱氢酶酶的利用率，进一步提高葡萄糖二酸的产量。目前国内外 还没有关于对生产葡萄糖二酸的重组菌细胞进行通透化处理的报道，因此通过物理、化学 方法，提高菌体细胞膜的通透性，促进细胞外营养物质进入细胞内或者细胞内代谢产物分 泌到胞外，克服胞内产物的抑制作用，对葡萄糖二酸的生产具有重要意义。
技术实现要素：
鉴于此，本发明提供了提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用， 该提高细胞通透性的方法具体为一种通过物理方法或化学方法对细胞进行处理的方法，使 用该方法进行细胞通透性处理，效果显著；将该方法应用于制备葡萄糖二酸中，可为生成葡 萄糖二酸的转化过程提供良好的转化环境。 本发明的技术方案如下： 一种提高细胞通透性的方法，具体为使用物理法或者化学法对细胞进行处理； 所述物理法为超声波破碎法或反复冻融法，其中，在超声波破碎法中，超声频率频 率25KHz，功率为200W，超声时间为20～100s；在反复冻融法中，反复冻融的时间为15min，次 3 CN 111593012 A 说 明 书 2/4 页 数为1～3次； 所述化学法为添加表面活性剂或添加有机溶剂作为通透剂，然后静置或慢速搅拌 悬浮液10～30min；其中，添加表面活性剂时，表面活性剂的浓度为0.1～5g/L。 优选的，在化学法中，所述表面活性剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚(曲拉通X-100) 或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)中的一种。 优选的，在化学法中，所述有机溶剂为甲苯，浓度为0.3％。 上述提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用，过程为：发酵培养 表达葡醛酸脱氢酶的细胞，使用物理方法或化学表面活性剂对细胞进行通透化处理，利用 通透化处理过的细胞来生产葡萄糖二酸。 上述提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用，步骤如下： (1)重组大肠杆菌的构建：将葡醛酸脱氢酶基因插入表达载体中，并导入宿主菌中 表达，获得重组大肠杆菌； (2)收集细胞悬液：活化步骤(1)获得的重组大肠杆菌菌株，接种到LB培养基中，37 ℃，220rpm条件下振荡培养，至OD600为0.6～1.0时，添加IPTG进行诱导并降低温度继续培养 6～18h；4℃离心收获菌泥；将菌泥用Tris-Hcl洗涤、MOPS反应液重悬后培养，获得菌泥重悬 液； (3)细胞通透性处理：将步骤(2)中菌泥重悬液进行细胞通透性处理，提高细胞通 透性；促进细胞对底物的吸收以及克服胞内产物的抑制作用； (4)添加底物：向步骤(3)中细胞通透化处理过的菌悬液中添加一定浓度的葡萄糖 醛酸，继续37℃，200rpm条件下振荡培养10h； (5)产物的测定：采用超高效液相色谱(HPLC)定量测定发酵产生的葡萄糖二酸。 进一步的，在步骤(1)中，所述葡醛酸脱氢酶来源于氨基酸序列为SEQ IDNO.1的假 单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonas synxantha strain KENGFT3)和氨基酸序列为SEQ ID NO .2的脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas fragi strain P121)；所述的表达载体为 pETDuet-1；所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌XL1-Blue或大肠杆菌Rosetta。 优选的，在步骤(2)中，所述诱导剂IPTG的添加量为0.4mM。 优选的，在步骤(2)中，所述添加IPTG之后重组大肠杆菌的培养温度为26℃、培养 时间18h。 优选的，在步骤(2)中，所述菌泥的添加量为5～10g/L；所述Tris-Hcl洗涤液的pH 为7.5，浓度为25mM；所述MOPS的pH为7.5，浓度为100mM。 与现有技术相比，本发明的有益效果： (1)本发明通过对重组工程菌进行细胞通透化处理生产葡萄糖二酸，与未进行通 透化处理的重组工程相比，葡萄糖二酸的产量有所提高。 (2)本发明通过改善工业菌株的细胞通透性来提高目标产物的发酵水平，针对性 非常强，符合工业生产菌株的育种需要，易于在其他工业微生物菌种的育种改造中推广应 用。 (3)本发明填补了国内外关于利用表面活性剂重组工程菌生产葡萄糖二酸的技术 空白，为微生物育种提供了一条全新的方法。 4 CN 111593012 A 说 明 书 3/4 页
