技术摘要：
本发明公开了一种血清中激素和神经递质的检测方法。本发明对传统血清检测方法进行改进，前处理时在血清中加入20μL 100ppb同位素内标，加入400μL 90v/v％乙腈水，乙腈水含0.1v/v％甲酸；涡旋1min，在4℃下静置20min；4℃、15000rpm下离心10min，取上清液加入20mg PSA( 全部
背景技术：
激素是内分泌细胞产生的一类具有高效能信息传递作用的化学物质。激素的种类 较多而数量极微(多数为毫微克甚至微微克水平)，它们不直接参与物质或能量的转换，只 是直接或间接地促进或减慢体内原有的代谢过程。如生长和发育都是人体原有的代谢过 程，生长激素或其他相关激素增加，可加快这一进程，减少则使生长发育迟缓。激素对人类 的繁殖、生长、发育、各种其他生理功能、行为变化以及适应内外环境等，都能发挥重要的调 节作用。一旦激素分泌失衡，便会给人体带来各种疾病。 神经传递是神经元之间沟通的基础，对大脑发育、行为、情感和生命维持起到至关 重要的作用。神经传递系统包括神经递质及其前体物质和代谢物质。神经递质是一类化学 物质，在神经元、肌细胞、感受器的突触传递中起信使作用，对生理功能起着很大的作用。按 照神经传递系统的不同，神经递质可分为血清素能、胆碱能、儿茶酚胺能、肾上腺素能类。神 经递质改变可引起抑郁症、帕金森病和精神分裂等病，如帕金森病的主要表现是体内多巴 胺含量的下降，对此在治疗过程中会使用多巴胺的前体物质左旋多巴。 因此，血液中激素和神经递质的水平是身体健康状况的重要指示指标。目前，很多 疾病的诊断和治疗需要对血液中的激素和神经递质进行检测，血液中的激素和神经递质水 平已经成为临床医学检测的重要指标。目前，检测血液(血清)中激素和神经递质常用的方 法包括酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和高效液相色谱法。 ELISA无法同时检测样品中的多种指标且由于样品中的其他内源性抗原易吸附固相载体， 发生交叉反应，难免造成假阳性或假阴性，而且操作复杂。高效液相色谱法能够同时分析多 种目标待测物且具有较高的敏感性和特异性，逐渐成为在医学检测中广泛应用的可靠技 术。然而，在使用高效液相色谱法检测血液(血清)样品中的激素和神经递质的过程中，一般 需要对样品进行前处理，目前应用的前处理方法主要有固相萃取法(SPE)和蛋白质沉淀法 (PPT)。这些方法或是对目标化合物的提取效率低，损失大，或是杂质去除效率低，基质效应 高，对检测仪器损害大，均存在明显不足之处，很难满足临床检测上高通量、高准确度的要 求。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种全新的血清前处理技术，并通 过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC/ESI-MS/MS)对血清中的多种激素和神经递质进行同时 检测。 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的，包括以下步骤： 3 CN 111595956 A 说 明 书 2/12 页 (1)血清样品的前处理：取100μL血清于1.5mL离心管中，加入20μL 100ppb同位素 内标，加入400μL 90v/v％乙腈水，乙腈水含0.1v/v％甲酸；涡旋1min，在4℃下静置20min；4 ℃、15000rpm下离心10min，取上清液加入20mg PSA(N-丙基乙二胺)，10mg中性Al2O3以及 10mg C18；涡旋1min，混匀后在4℃、15000rpm下离心10min，取上清液氮吹干，并用200μL 5v/ v％乙腈水复溶，乙腈水含0.1v/v％甲酸。复溶后涡旋1min，过0.22μm滤膜，上样。 (2)液质联用技术同时定量分析血清中神经递质和激素：分析用的是Waters BEH C 柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，并在前端串联一根VanGuardTM18 保护柱(C18柱，2.1mm×50mm，1.7 μm)。流动相用二元洗脱液，A路乙腈，B路水，均添加0.1v/v％的甲酸，流速为0.2mL/min，进 样量为10μL。设置的梯度是0min，5v/v％A；3min，6v/v％B；5min，25v/v％B；7min，95v/v％A； 11min，5v/v％A。质谱使用选择反应监测(selected reaction monitoring，SRM)模式。毛细 管电压为1.07kV。氮气用作脱溶剂气，气体的温度和流速分别为350℃和800L/h。氩气为碰 撞气。 进一步地，所述同位素内标配置如下： (1)用50v/v％乙腈水溶液配置浓度为1000ppm的各神经递质同位素母液，将单标 分步稀释至100ppm、10ppm； (2)用纯乙腈配置浓度为1000ppm的各激素同位素母液，将单标分步稀释至 100ppm、10ppm； (3)同位素内标：每种10ppm同位素单标各取100μL混合于离心管中，用5v/v％乙腈 水溶液配置成10mL浓度为100ppb的同位素内标。 进一步地，所述神经递质包括：乙酰胆碱、血清素、多巴胺、左旋多巴、去甲肾上腺 素和去甲变肾上腺素。所述激素包括：醛固酮、雄烯二酮、雄酮、肾上腺酮、皮质醇、11﹣脱氧 皮质醇、雌二醇、雌酮、17α﹣羟基孕酮、孕酮、睾酮、孕烯醇酮、甲状腺素、3,3,5﹣三碘甲状腺 原氨酸、肾上腺素、褪黑素、后叶加压素、血管紧张素、前列腺素D2、前列腺素E2、前列腺素F1α 和血栓素B2。 本发明的有益效果是：本发明的前处理方法相比于传统的蛋白质沉淀法仅多了一 步简便的纯化步骤，能够满足在减少损失的基础上对样品进行净化，解决了蛋白质沉淀法 造成的基质效应过高、样品洁净度差、对仪器污染大等缺点。同时，以同位素内标来跟踪和 校正样品分析过程中目标化合物的损失，确保结果的准确性。 附图说明 图1为28种生物标志物质谱图。
本发明公开了一种血清中激素和神经递质的检测方法。本发明对传统血清检测方法进行改进，前处理时在血清中加入20μL 100ppb同位素内标，加入400μL 90v/v％乙腈水，乙腈水含0.1v/v％甲酸；涡旋1min，在4℃下静置20min；4℃、15000rpm下离心10min，取上清液加入20mg PSA( 全部
背景技术：
激素是内分泌细胞产生的一类具有高效能信息传递作用的化学物质。激素的种类 较多而数量极微(多数为毫微克甚至微微克水平)，它们不直接参与物质或能量的转换，只 是直接或间接地促进或减慢体内原有的代谢过程。如生长和发育都是人体原有的代谢过 程，生长激素或其他相关激素增加，可加快这一进程，减少则使生长发育迟缓。激素对人类 的繁殖、生长、发育、各种其他生理功能、行为变化以及适应内外环境等，都能发挥重要的调 节作用。一旦激素分泌失衡，便会给人体带来各种疾病。 神经传递是神经元之间沟通的基础，对大脑发育、行为、情感和生命维持起到至关 重要的作用。神经传递系统包括神经递质及其前体物质和代谢物质。神经递质是一类化学 物质，在神经元、肌细胞、感受器的突触传递中起信使作用，对生理功能起着很大的作用。按 照神经传递系统的不同，神经递质可分为血清素能、胆碱能、儿茶酚胺能、肾上腺素能类。神 经递质改变可引起抑郁症、帕金森病和精神分裂等病，如帕金森病的主要表现是体内多巴 胺含量的下降，对此在治疗过程中会使用多巴胺的前体物质左旋多巴。 因此，血液中激素和神经递质的水平是身体健康状况的重要指示指标。目前，很多 疾病的诊断和治疗需要对血液中的激素和神经递质进行检测，血液中的激素和神经递质水 平已经成为临床医学检测的重要指标。目前，检测血液(血清)中激素和神经递质常用的方 法包括酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和高效液相色谱法。 ELISA无法同时检测样品中的多种指标且由于样品中的其他内源性抗原易吸附固相载体， 发生交叉反应，难免造成假阳性或假阴性，而且操作复杂。高效液相色谱法能够同时分析多 种目标待测物且具有较高的敏感性和特异性，逐渐成为在医学检测中广泛应用的可靠技 术。然而，在使用高效液相色谱法检测血液(血清)样品中的激素和神经递质的过程中，一般 需要对样品进行前处理，目前应用的前处理方法主要有固相萃取法(SPE)和蛋白质沉淀法 (PPT)。这些方法或是对目标化合物的提取效率低，损失大，或是杂质去除效率低，基质效应 高，对检测仪器损害大，均存在明显不足之处，很难满足临床检测上高通量、高准确度的要 求。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种全新的血清前处理技术，并通 过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC/ESI-MS/MS)对血清中的多种激素和神经递质进行同时 检测。 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的，包括以下步骤： 3 CN 111595956 A 说 明 书 2/12 页 (1)血清样品的前处理：取100μL血清于1.5mL离心管中，加入20μL 100ppb同位素 内标，加入400μL 90v/v％乙腈水，乙腈水含0.1v/v％甲酸；涡旋1min，在4℃下静置20min；4 ℃、15000rpm下离心10min，取上清液加入20mg PSA(N-丙基乙二胺)，10mg中性Al2O3以及 10mg C18；涡旋1min，混匀后在4℃、15000rpm下离心10min，取上清液氮吹干，并用200μL 5v/ v％乙腈水复溶，乙腈水含0.1v/v％甲酸。复溶后涡旋1min，过0.22μm滤膜，上样。 (2)液质联用技术同时定量分析血清中神经递质和激素：分析用的是Waters BEH C 柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，并在前端串联一根VanGuardTM18 保护柱(C18柱，2.1mm×50mm，1.7 μm)。流动相用二元洗脱液，A路乙腈，B路水，均添加0.1v/v％的甲酸，流速为0.2mL/min，进 样量为10μL。设置的梯度是0min，5v/v％A；3min，6v/v％B；5min，25v/v％B；7min，95v/v％A； 11min，5v/v％A。质谱使用选择反应监测(selected reaction monitoring，SRM)模式。毛细 管电压为1.07kV。氮气用作脱溶剂气，气体的温度和流速分别为350℃和800L/h。氩气为碰 撞气。 进一步地，所述同位素内标配置如下： (1)用50v/v％乙腈水溶液配置浓度为1000ppm的各神经递质同位素母液，将单标 分步稀释至100ppm、10ppm； (2)用纯乙腈配置浓度为1000ppm的各激素同位素母液，将单标分步稀释至 100ppm、10ppm； (3)同位素内标：每种10ppm同位素单标各取100μL混合于离心管中，用5v/v％乙腈 水溶液配置成10mL浓度为100ppb的同位素内标。 进一步地，所述神经递质包括：乙酰胆碱、血清素、多巴胺、左旋多巴、去甲肾上腺 素和去甲变肾上腺素。所述激素包括：醛固酮、雄烯二酮、雄酮、肾上腺酮、皮质醇、11﹣脱氧 皮质醇、雌二醇、雌酮、17α﹣羟基孕酮、孕酮、睾酮、孕烯醇酮、甲状腺素、3,3,5﹣三碘甲状腺 原氨酸、肾上腺素、褪黑素、后叶加压素、血管紧张素、前列腺素D2、前列腺素E2、前列腺素F1α 和血栓素B2。 本发明的有益效果是：本发明的前处理方法相比于传统的蛋白质沉淀法仅多了一 步简便的纯化步骤，能够满足在减少损失的基础上对样品进行净化，解决了蛋白质沉淀法 造成的基质效应过高、样品洁净度差、对仪器污染大等缺点。同时，以同位素内标来跟踪和 校正样品分析过程中目标化合物的损失，确保结果的准确性。 附图说明 图1为28种生物标志物质谱图。
