技术摘要：
本发明提供了一株可用于制备阿魏酸酯酶AnfaeA的马克斯克鲁维酵母重组菌株，其通过将序列优化后的黑曲霉阿魏酸酯酶AnfaeA基因克隆到表达载体上并转化马克斯克鲁维酵母宿主菌株构建所得，该重组菌株经高密度发酵阿魏酸酯酶的产量达12,0000U/ml。本发明还提供了一种利用阿  全部
背景技术：
阿魏酸酯酶(feruloyl  esterases，EC  3.1.1.73)又称为肉桂酸酯酶，是羧酸酯水 解酶的一  个亚类。由于阿魏酸酯酶能够水解阿魏酸等酚酸与半纤维素、木质素等相互作用 的酯键，打  破植物细胞壁中的致密网状结构，使纤维素暴露，从而提高纤维素的降解率并 释放出阿魏酸  等抗氧化物质，因而被广泛应用于食品、造纸、饲料、医药等领域，具有很高 的应用价值。  例如，生物加工领域中，在生成生物乙醇等产品时，阿魏酸酯酶被认为是完成 木质纤维素水  解所必须的辅助酶，阿魏酸酯酶与其他水解酶和氧化酶的结合使用，能显著 促进了植物材料 的分解以及提高可发酵碳水化合物的利用率。食品及医药领域中，阿魏酸 和其他羟基肉桂酸  是酚类植物性化学物质，由于其独特和有效的特性，如可作为抗氧化 剂、防晒因子、脱色素  剂等而广泛用于食品和化妆品行业。阿魏酸等羟基肉桂酸可作为维 生素C和E的载体，使  皮肤光防护增强，同时由于亲脂性更强，从而能更好地渗透到角质层。 此外，它们还具有多  种药效及保健功能，例如抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗血栓等。制浆造纸工 业中为生产出高品  质的纸张，白度是木浆的一个重要特性。纸浆的变色是由纸浆中残留的 木质素引起的，漂泊  是去除残余木质素使纸浆变白的关键步骤。工业上通常使用二氧化 氯、过氧化氢或臭氧这类  高成本且危险的化学试剂来实现化学漂白，对环境有很大的危 害。而将阿魏酸酯酶与木聚糖  酶和木质素氧化酶混合使用处理纸浆时，脱木素率与化学漂 白的结果相当。同时生物漂白过  程也降低了能耗，显著降低了制浆废水的化学需氧量值， 对环境友好。饲料工业中纤维消化  率是动物饲料的重要指标。消化不良会阻碍动物生长， 引起免疫应激反应，降低牲畜的饲料  转化率，使养殖的收益降低。阿魏酸和羟基肉桂酸自 生对动物的健康有益，但植物细胞壁成  分的阿魏酸化是反刍动物消化系统的主要抑制因 素之一，在饲料中添加阿魏酸酯酶可以加速  植物细胞壁成分的降解，提高植物营养素的纤 维消化，同时还能提高动物对饲料的消化程度，  加速动物生长。 自20世纪80年代阿魏酸酯酶被首次鉴定及1991年被首次分离纯化以来，已从微生 物 中得到了80多种具有不同分子量、底物偏好和最佳反应条件的阿魏酸酯酶。不同微生物 来  源的阿魏酸酯酶的蛋白同源性、理化性质和作用机理均有明显差异，基于酶的生化和功 能特  征、对含羟基肉桂酸甲酯(阿魏酸甲酯、p-香豆酸甲酯、咖啡酸甲酯和芥子酸甲酯)底 物的  识别和利用以及氨基酸序列相似性，阿魏酸酯酶被分为A、B、C、D、E型。A型阿魏酸酯  酶优先选择间位甲氧基取代的酚类化合物作为底物，尤其是阿魏酸和芥子酸，但其活性只 体  现在含有与O-5连接的阿魏酸酯底物上，当底物含有与L-阿拉伯呋喃糖的O-2连接的阿 魏  酸酯时，即不具有催化活性；B型阿魏酸酯酶则倾向于选择p-香豆酸和咖啡酸等含有1-2 个  羟基的底物，且对含有与L-阿拉伯呋喃糖的O-5和O-2连接的阿魏酸酯底物均具有活性。  3 CN 111592990 A 说　明　书 2/7 页 两种类型的阿魏酸酯酶另一个不同之处在于，A型阿魏酸酯酶对苯环上含有较大取代基的 疏  水底物具有更高的选择性。C型和D型阿魏酸酯酶仅在释放阿魏酸二聚体的能力上有所 差  异，而对人工合成的羟基肉桂酸酯具有广泛的特异性。A型和D型阿魏酸酯酶能产生少量  的阿魏酸二聚体。此外，系统发育进化分析还表明某些微生物来源的阿魏酸酯酶不属于这 四  个分类中的任意一种，因而被归为假定的E型。这一类型的阿魏酸酯酶只能根据其氨基 酸  序列的一致性来鉴定，由于缺乏可比较的酶活数据，无法建立进一步的相关性。 尽管阿魏酸酯酶能够被多种微生物合成，但是由于野生菌株的产酶能力有限，目 前还未 能直接用于大规模生产。利用分子生物学手段构建基因工程菌株，从而获得稳定性 及产量更  高的生产菌株成为了研究热点。现有技术中已经有多个阿魏酸酯酶编码基因被 克隆并进行异  源表达，其中以大肠杆菌(Escherichia  coli)、毕赤酵母(Pichia  pastoris)和黑曲霉(Aspergillus niger)为最常见的表达系统。大肠杆菌表达系统是最常 用的表达体系，但是也有其缺陷之  处，缺少真核基因表达所必须的翻译后修饰，蛋白表达 后往往不能正确折叠，容易形成无活  性的包涵体，虽然可以通过亲和色谱法变性和纯化， 但这些操作会导致蛋白质的损失，使酶 活性降低，这些缺陷一定程度上限制了大肠杆菌表 达系统的应用。
技术实现要素：
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供了一种生产成本低、工艺简 单以及  更安全的阿魏酸酯酶制备方法及其应用；本发明提供的阿魏酸酯酶制备方法，可用 于工业相 关生产领域的应用。 作为一种实施形态，本发明提供了一种重组表达阿魏酸酯酶的马克斯克鲁维酵母 菌株，  其特征在于，通过将来源于黑曲霉的阿魏酸酯酶基因克隆到重组表达载体，并转化 马克斯克  鲁维酵母菌株而构建得到。 上述重组表达阿魏酸酯酶的马克斯克鲁维酵母菌株中还可以具有这样的技术特 征，阿魏  酸酯酶基因的序列如SEQ  ID  No.1所示，或由SEQ  ID  No.1所示的核苷酸序列经过 取代、缺  失或添加一个或几个核苷酸而得到且其编码的蛋白质具有阿魏酸酯酶活性的衍 生核苷酸序  列。 上述重组表达阿魏酸酯酶的马克斯克鲁维酵母菌株中还可以具有这样的技术特 征，阿魏  酸酯酶基因的序列为如SEQ  ID  No.2所示的核苷酸序列，或为由如SEQ  ID  No.2所 示的核苷  酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸而得到且其编码的蛋白质具有 阿魏酸酯酶活 性的衍生核苷酸序列。 上述重组表达阿魏酸酯酶的马克斯克鲁维酵母菌株中还可以具有这样的技术特 征，将阿  魏酸酯酶基因转入马克斯克鲁维酵母菌株的载体包含酵母自主复制序列、菊粉酶 启动子、阿  魏酸酯酶基因、菊粉酶终止子、筛选标记基因序列，载体的具体序列如SEQ  ID  No.6所示。 上述实施形态的重组表达阿魏酸酯酶的马克斯克鲁维酵母菌株中，还可以具有这 样的技  术特征，马克斯克鲁维酵母菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编 号为  CGMCC  No.10621。 作为另一种实施形态，本发明提供了一种阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，利 4 CN 111592990 A 说　明　书 3/7 页 用如  上任一项所述的重组表达阿魏酸酯酶的马克斯克鲁维酵母菌株经发酵培养获得阿魏 酸酯酶 液。 作为又一种实施形态，本发明还提供了前述阿魏酸酯酶的制备方法制备得到的阿 魏酸酯  酶液的应用，即，提供了一种阿魏酸的制备方法，其特征在于，采用如上所述的阿魏 酸酯酶 的制备方法制备得到阿魏酸酶液，将该阿魏酸酶液作为水解酶对农业副产品进行 水解获得阿  魏酸。 上述阿魏酸的制备方法中还可以具有这样的技术特征，水解酶中还加入了木聚糖 酶、木  糖苷酶、纤维素酶中的任意一种或几种的组合。 上述阿魏酸的制备方法中还可以具有这样的技术特征，其中，农业副产品为米糠、 麦麸、  玉米皮、玉米芯、豆粕中的任意一种或几种的组合。 发明的作用与效果 根据本发明所提供的重组表达阿魏酸酯酶的马克斯克鲁维酵母菌株以及利用该 菌株制  备阿魏酸酯酶的方法，由于将来源于黑曲霉的阿魏酸酯酶基因进行序列优化、克隆 到重组表  达载体并转化马克斯克鲁维酵母菌株，其所得的重组菌株能够正常表达阿魏酸 酯酶并得到高  酶活的阿魏酸酯酶，因此具有良好的实际应用价值，包括作为水解酶应用于 降解米糠、麦麸、  玉米皮、玉米芯、豆粕等农业副产物并释放得到阿魏酸。 附图说明 图1为本发明实施例1的黑曲霉来源的阿魏酸酯酶AnfaeA基因的PCR扩增产物的电 泳 图。 图2为本发明实施例5黑曲霉来源的阿魏酸酯酶AnfaeA发酵液的SDS-PAGE分析。 图3为本发明实施例6的黑曲霉来源的阿魏酸酯酶AnfaeA的酶活检测结果。 图4为本发明实施例7的黑曲霉来源的阿魏酸酯酶AnfaeA马克斯克鲁维酵母重组 菌株 的高密度发酵生长曲线。 图5为本发明实施例7的黑曲霉来源的阿魏酸酯酶AnfaeA马克斯克鲁维酵母重组 菌株 的高密度发酵酶活情况。 图6为本发明实施例的黑曲霉来源的阿魏酸酯酶AnfaeA马克斯克鲁维酵母重组菌 株的 高密度发酵SDS-PAGE分析结果。 图7为本发明实施例的黑曲霉来源的阿魏酸酯酶AnfaeA马克斯克鲁维酵母重组菌 株的 发酵液在有/无木聚糖酶存在下对玉米芯进行24小时降解从而释放阿魏酸的情况。