技术摘要：
本发明提出了一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备及其菌株和应用，培养得到以酸性蛋白酶为主，果胶酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、阿魏酸酯酶、羧肽酶、磷酸酶多种伴生酶为辅的富含天然复杂酶类的多酶系酸性蛋白酶 全部
背景技术：
随着日益增长的禽类产品需求，饲养业对于人们的重要性逐年上升，对禽畜饲养 的安全性、高效性、环保性提出了更高的要求。“禽以食为天”，饲料作为饲养业关键环节之 一，受到高度重视。形势上，近年来对抗生素的使用控制越来越严格，中国在2020年进入“禁 抗”时代，饲料添加剂中禁止检出规定中的抗生素。双趋势下直接推动了饲料的制作工艺、 添加剂等产品的质量优化热潮，其中就包括以酸性蛋白酶为主的酶制剂。专利CN 110973371 A公开了一种畜禽蛋白酶饲料添加剂，酸性蛋白酶作为主要成分之一按百分比 配置该添加剂。专利CN 109965084 A公开了一种固体发酵豆粕生产高蛋白饲料的方法，其 中是以添加了酸性蛋白酶的发酵原料进行固体发酵。 酸性蛋白酶是蛋白酶大类的分支，是一种能在酸性(pH值2～5)条件下将大分子蛋 白质迅速水解成肽类和部分游离氨基酸的酶类，催化结构域活性中心为天冬氨酸蛋白酶。 其相对分子量在30～45kDa之间，等电点为3.0～5.0。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和 微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。微生物蛋白酶一个显著特点是 具有多样性和复杂性，通常一株菌株可分泌一种或多种酸性蛋白酶，主要生产菌种有黑曲 霉、宇佐美曲霉等。良好的水解蛋白能力和耐酸性，使得酸性蛋白酶具有广阔的应用空间， 包括食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。而上述饲料领域的变革，对酸性蛋白 酶在饲料领域的应用发展起到积极促进作用。 在饲料工业中，添加酸性蛋白酶可以有效提高饲料中蛋白类营养物质的利用率， 主要是幼龄动物自身的消化分泌不健全，添加酸性蛋白酶可以将大分子蛋白质降解为多肽 类物质，有助于提高消化吸收，降低饲料对其消化道的刺激，减少营养障碍。酸性蛋白酶对 禽畜的促生长作用，使其成为抗生素的良好替代品之一。郭建来等(2007)研究发现，在仔猪 日粮中添加0.1％的酸性蛋白酶，可以显著提高仔猪的生长性能，并显著降低腹泻率。 在研究分析方向，酸性蛋白酶的分离纯化、分析鉴定、酶学性质等技术日益成熟。 谢必峰等(2007)采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋白酶，并 对该酶的氨基酸组分进行了分析。王云(2008年)通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋 白进行了分析比对，鉴定为曲霉酸性蛋白酶后对该酶进行了分子生物学方面的研究。 在优化产能方面，提高酸性蛋白酶的活性和适应性是酸性蛋白酶优化中最主要的 促进点，改良菌种和培养条件成为最常见的优化方式。王水顺等(2002年)通过紫外线和亚 硝基胍复合诱变的方法获得一株复合酶高产菌株SL2-III，在此基础上，以酸性蛋白酶发酵 酶活为响应值，采用单因素搜索和正交试验对变株SL2-III固体发酵工艺进行优化，优化后 酶活达到6428U/g。专利CN 107760612 B公开了以黑曲霉为出发菌株，采用紫外线(UV)与亚 硝基胍(NTG)联合诱变技术，筛选出产酸性蛋白酶的黑曲霉yy07(Aspergillus niger 4 CN 111593036 A 说 明 书 2/12 页 yy07)菌株，该菌株通过固体发酵生产饲用酸性蛋白酶的最高酶活达1646U/g。专利CN 107586789 A中，公开了构建酸性蛋白酶的表达盒、导入黑曲霉表达宿主菌、获得高产酸性 蛋白酶黑曲霉表达菌株的基因工程方法。该改造菌株液体发酵条件优化后酸性蛋白酶的表 达水平可达25000-26000U/ml。CN 105199969 B公开了一种液体发酵酸性蛋白酶通过液体 深层发酵配合补料工艺，产酶水平为21852U/mL。CN101948820 A公开了一种酸性蛋白酶及 其制备方法，以黑曲霉CICC2238为产酶菌种，麦麸为主要原料生从的酸性蛋白酶最适 pH2.5-3.5，最适作用温度40-50℃，采用固体发酵工艺制备的酸性蛋白酶酶活≥47000U/g， 液体酶收率≥85％，固体酶收率≥80％。专利CN 110904083 A中，运用固体发酵产酸性蛋白 酶，其酶活常规达到7万U/g，工艺设计优化后产出酸性蛋白酶酶活力为8-10万U/g。 酶制剂的巨大市场，推动纷繁多样的酶制剂产品问世。酸性蛋白酶酶制剂大类中， 液体深层发酵后分离纯化所得多为单一酸性蛋白组分的酶制剂；由酸性蛋白酶、中性蛋白 酶、碱性蛋白酶等组分单一的纯酶按百分比等配比形式混合在一起的为组合式蛋白酶(部 分产品称此类酶为复合酶)；一到两种蛋白酶为主酶、果胶酶、木聚糖酶等几十上百种辅酶 在发酵代谢过程中自然产生、协同作用底物的多酶体系构成复合酶，一般固体发酵得到的 产物即为真正意义上的复合酶式蛋白酶。针对不同的用途，选用相应的酶制剂。 环保和经济效益方面，随着集约化畜禽养殖业的发展，养殖动物氮的排放成为污 染环境的主要物质。因而提高饲料中蛋白类营养物质的利用效率，降低氮排放就显得尤为 重要。乔伟等(2017)综合分析后，发现运用酸性蛋白酶后，麸皮、秸秆等低蛋白发酵原料得 到很好的消化降解，氮磷在禽畜体内的利用率提高，排放量下降，环境友好程度上升。饲养 禽畜料肉比减小，健康状况得到改善，收益率增加，经济效益稳中有升。丹麦和瑞士研究人 员研究了在肉鸡日粮中添加蛋白酶降低日粮蛋白含量对改善环境的影响，发现使用蛋白酶 可以显著降低畜牧生产中的氮排放。 根据上述酸性蛋白酶的研究进展可知，目前的酸性蛋白酶发展趋势良好，市场需 求大，生产技术逐步优化。但分析发现，依旧存在如下问题： 1 .在应用效果及优化工艺上，酸性蛋白酶酶活依旧有较大上升空间，可以进一步 提高酶解效率。 2.酶制剂的酶蛋白检测方法成熟，但应用相对单一，通常是针对某种蛋白质进行 分析。处理蛋白组分多、分离提纯难度大的固体发酵产物，此种方法不适宜，需要找到更适 合的方法。 3.目前未找到对固体发酵酸性蛋白酶的酶系进行系统研究的报道，模糊不清的粗 放生产对后续深入研究菌种、多酶相互作用、优化发酵工艺思路的拓宽等均有不利影响。 4.基于发酵饲料的原料越来越趋向于麸皮、秸秆、棉粕等农业残渣，酶制剂中的酶 系需与发酵原料的复杂结构相对应，才能起到良好的酶解效果。单酶或组和酶酶系与发酵 原料的复杂结构的对应性较差，酶解效率受抑制。 5.液体发酵工艺成熟、过程可控，是一种可行的生产酶制剂的发酵工艺。但后续的 分离纯化、冷冻干燥等后处理过程耗能大，对设备有较高要求，对厂家成本要求高。且液体 发酵的产物较固态发酵少，酶系丰富程度低于固体发酵。 5 CN 111593036 A 说 明 书 3/12 页
技术实现要素：
本发明提出一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备及其菌株和应用，以解决上述 技术问题。 本发明的技术方案是这样实现的： 一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其中， 所述菌株为黑曲霉(Aspergilus niger)BAK200389，保藏号CGMCC No.19613； 培养得到以酸性蛋白酶为主，果胶酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、 葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、阿魏酸酯酶、羧肽酶、磷酸酶多种伴生酶为辅的富含 天然复杂酶类的多酶系酸性蛋白酶制剂。 在一些实施例中，所述酶制剂的制备包括：一级斜面培养、二级液体种子制备、三 级液体种子制备、扩大培养一级固体培养； 其中，(1)一级斜面培养 将菌种黑曲霉(Aspergilus niger)BAK200389接种至土豆汁葡萄糖斜面培养基 上，28℃～31℃培养5～7d，得到萌发孢子的斜面； (2)二级液体种子制备 取步骤(1)中斜面上的孢子菌丝混合物，接种至摇瓶中的液态培养基，摇床震荡培 养；瓶内种子菌液呈粘稠状后终止培养，冷藏保存； (3)三级液体种子制备 将步骤(2)中培养好的摇瓶打开，取液态种子接种至三级摇瓶中的液态培养基，摇 床震荡培养； (4)扩大培养 发酵罐内注入液态培养基，进行高压蒸汽灭菌60～80min；停止灭菌后温度降至20 ～35℃并保持；取步骤(3)中已培养好的液态种子，通过灭菌发酵罐口快速倒入发酵罐中， 通无菌空气，搅拌培养； (5)固体培养基的接种培养 将步骤(4)中培养好的液态培养基按5％～15％的重量比放入固体发酵培养基中， 将固体发酵培养基混合均匀后，静置发酵培养；相对湿度80～90％，料温28℃～35℃，发酵 周期3～5d； 固体发酵培养基按下述比例配制：麸皮85～95％，豆粕粉5～15％，硫酸铵0.5～ 1.5％，初始水分40～55％，pH自然。 在一些实施例中，所述液态培养基按下述重量比例配制(％)：麦芽糊精4 .0～ 8.0％，葡萄糖2.0～3.5％，蛋白胨0.5～2.0％，细麸皮1.0～3.0％，pH自然。 在一些实施例中，所述摇床震荡培养条件：28℃～30℃，转速180～220r，培养周期 1～3d；所述的固体发酵培养基的灭菌要求：121℃，0.1MPa，40～60min；所述的冷藏保存的 条件：4℃，5～8d。 在一些实施例中，所述发酵罐培养的要求：27℃～32℃，搅拌转速150～200r，培养 周期1～3d；所述发酵罐的灭菌要求：121℃，0.1MPa，60～80min； 所述发酵罐罐口的灭菌要求：接种操作前酒精火圈灼烧3～5min，接种期间保持火 不灭，接种完毕后关闭罐口，火圈撤离并熄灭。 6 CN 111593036 A 说 明 书 4/12 页 在一些实施例中，还包括发酵产物的烘干步骤和粉碎步骤；其中，烘干至含水量5 ～15％停止。 本发明还提供了一种黑曲霉(Aspergilus niger)，命名为黑曲霉BAK200389，其保 藏号为CGMCC No.19613。 本发明还提供了一种畜禽饲料，包括上述黑曲霉BAK200389的培养产物。 本发明相比于现有技术具有以下有益效果： (1)本发明产出的酶之间具有很好的补充和配合作用，对裂解植物细胞壁中的大 分子化学键、松散致密有序的空间结构、生成多种有益代谢产物具有重要的协同作用。 (2)本发明所用菌株，可一菌产多酶，具有生长稳定、产酶种类较多、安全的特性。 (3)本发明提供的酸性蛋白酶酶制剂，产酶经特定底物诱导更具有针对性，拥有7 大类、38种酶蛋白。代表酶系包括：酸性蛋白酶、果胶酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露 聚糖酶、葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、阿魏酸酯酶、羧肽酶、磷酸酶等。 (4)本发明提供的多酶系酸性蛋白酶酶活可观。根据相关国家标准检测，日常保持 在9-11万，最高可达12万左右，高于已知饲料酸性蛋白酶生产酶活。目前市面销售的酸性蛋 白酶，均为液体发酵浓缩干燥而成，常规酶活为50000U/g，有少部分10万U/g或20万U/g，固 体发酵酸性蛋白酶酶活在3-5万U/g左右。 (5)本发明中，采用现代固体发酵工艺和蛋白质组学检测理论的组合模式，以现代 固体发酵理论指导下的生产工艺为基础：针对性底物诱导发酵，通过呼吸袋静置发酵，发酵 期间较严格控制培养参数；以蛋白质组学检测方法进行研究：高效率检测酶制剂中的所有 酶蛋白及有益于禽畜的代谢产物，依据检测结果可对固体发酵的各类优化进行针对性调 整，两者相辅相成。 与传统的固液发酵工艺、检测单一或少量蛋白酶的检测方法相比，操作更简单，卫 生指标有了改善，研究方向更全面深入，功能更明确，对后续各方面的优化的指导意义更直 接。 (6)本发明提供的多酶系酸性蛋白酶具有很强的稳定性，可以避免在运输、加工、 贮存过程中的酶活损失。 (7)本发明提供的多酶系酸性蛋白酶制剂可作为饲料添加剂添加到大部分禽畜的 基础日粮中，包括但不限制于鸡，鸭，猪，兔子等禽畜。具有刺激免疫，提高机体健康水平等 作用。 (8)本发明提供的多酶系酸性蛋白酶制剂可有效促进禽畜生产性能的提高，减少 养殖成本的同时，增加收入。 (9)本发明的酸性蛋白酶工艺环保，耗能低，利用农业和工业残渣为生产原料，成 本低，且工艺简单，较其他发酵方式更绿色环保。
本发明提出了一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备及其菌株和应用，培养得到以酸性蛋白酶为主，果胶酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、阿魏酸酯酶、羧肽酶、磷酸酶多种伴生酶为辅的富含天然复杂酶类的多酶系酸性蛋白酶 全部
背景技术：
随着日益增长的禽类产品需求，饲养业对于人们的重要性逐年上升，对禽畜饲养 的安全性、高效性、环保性提出了更高的要求。“禽以食为天”，饲料作为饲养业关键环节之 一，受到高度重视。形势上，近年来对抗生素的使用控制越来越严格，中国在2020年进入“禁 抗”时代，饲料添加剂中禁止检出规定中的抗生素。双趋势下直接推动了饲料的制作工艺、 添加剂等产品的质量优化热潮，其中就包括以酸性蛋白酶为主的酶制剂。专利CN 110973371 A公开了一种畜禽蛋白酶饲料添加剂，酸性蛋白酶作为主要成分之一按百分比 配置该添加剂。专利CN 109965084 A公开了一种固体发酵豆粕生产高蛋白饲料的方法，其 中是以添加了酸性蛋白酶的发酵原料进行固体发酵。 酸性蛋白酶是蛋白酶大类的分支，是一种能在酸性(pH值2～5)条件下将大分子蛋 白质迅速水解成肽类和部分游离氨基酸的酶类，催化结构域活性中心为天冬氨酸蛋白酶。 其相对分子量在30～45kDa之间，等电点为3.0～5.0。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和 微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。微生物蛋白酶一个显著特点是 具有多样性和复杂性，通常一株菌株可分泌一种或多种酸性蛋白酶，主要生产菌种有黑曲 霉、宇佐美曲霉等。良好的水解蛋白能力和耐酸性，使得酸性蛋白酶具有广阔的应用空间， 包括食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。而上述饲料领域的变革，对酸性蛋白 酶在饲料领域的应用发展起到积极促进作用。 在饲料工业中，添加酸性蛋白酶可以有效提高饲料中蛋白类营养物质的利用率， 主要是幼龄动物自身的消化分泌不健全，添加酸性蛋白酶可以将大分子蛋白质降解为多肽 类物质，有助于提高消化吸收，降低饲料对其消化道的刺激，减少营养障碍。酸性蛋白酶对 禽畜的促生长作用，使其成为抗生素的良好替代品之一。郭建来等(2007)研究发现，在仔猪 日粮中添加0.1％的酸性蛋白酶，可以显著提高仔猪的生长性能，并显著降低腹泻率。 在研究分析方向，酸性蛋白酶的分离纯化、分析鉴定、酶学性质等技术日益成熟。 谢必峰等(2007)采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋白酶，并 对该酶的氨基酸组分进行了分析。王云(2008年)通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋 白进行了分析比对，鉴定为曲霉酸性蛋白酶后对该酶进行了分子生物学方面的研究。 在优化产能方面，提高酸性蛋白酶的活性和适应性是酸性蛋白酶优化中最主要的 促进点，改良菌种和培养条件成为最常见的优化方式。王水顺等(2002年)通过紫外线和亚 硝基胍复合诱变的方法获得一株复合酶高产菌株SL2-III，在此基础上，以酸性蛋白酶发酵 酶活为响应值，采用单因素搜索和正交试验对变株SL2-III固体发酵工艺进行优化，优化后 酶活达到6428U/g。专利CN 107760612 B公开了以黑曲霉为出发菌株，采用紫外线(UV)与亚 硝基胍(NTG)联合诱变技术，筛选出产酸性蛋白酶的黑曲霉yy07(Aspergillus niger 4 CN 111593036 A 说 明 书 2/12 页 yy07)菌株，该菌株通过固体发酵生产饲用酸性蛋白酶的最高酶活达1646U/g。专利CN 107586789 A中，公开了构建酸性蛋白酶的表达盒、导入黑曲霉表达宿主菌、获得高产酸性 蛋白酶黑曲霉表达菌株的基因工程方法。该改造菌株液体发酵条件优化后酸性蛋白酶的表 达水平可达25000-26000U/ml。CN 105199969 B公开了一种液体发酵酸性蛋白酶通过液体 深层发酵配合补料工艺，产酶水平为21852U/mL。CN101948820 A公开了一种酸性蛋白酶及 其制备方法，以黑曲霉CICC2238为产酶菌种，麦麸为主要原料生从的酸性蛋白酶最适 pH2.5-3.5，最适作用温度40-50℃，采用固体发酵工艺制备的酸性蛋白酶酶活≥47000U/g， 液体酶收率≥85％，固体酶收率≥80％。专利CN 110904083 A中，运用固体发酵产酸性蛋白 酶，其酶活常规达到7万U/g，工艺设计优化后产出酸性蛋白酶酶活力为8-10万U/g。 酶制剂的巨大市场，推动纷繁多样的酶制剂产品问世。酸性蛋白酶酶制剂大类中， 液体深层发酵后分离纯化所得多为单一酸性蛋白组分的酶制剂；由酸性蛋白酶、中性蛋白 酶、碱性蛋白酶等组分单一的纯酶按百分比等配比形式混合在一起的为组合式蛋白酶(部 分产品称此类酶为复合酶)；一到两种蛋白酶为主酶、果胶酶、木聚糖酶等几十上百种辅酶 在发酵代谢过程中自然产生、协同作用底物的多酶体系构成复合酶，一般固体发酵得到的 产物即为真正意义上的复合酶式蛋白酶。针对不同的用途，选用相应的酶制剂。 环保和经济效益方面，随着集约化畜禽养殖业的发展，养殖动物氮的排放成为污 染环境的主要物质。因而提高饲料中蛋白类营养物质的利用效率，降低氮排放就显得尤为 重要。乔伟等(2017)综合分析后，发现运用酸性蛋白酶后，麸皮、秸秆等低蛋白发酵原料得 到很好的消化降解，氮磷在禽畜体内的利用率提高，排放量下降，环境友好程度上升。饲养 禽畜料肉比减小，健康状况得到改善，收益率增加，经济效益稳中有升。丹麦和瑞士研究人 员研究了在肉鸡日粮中添加蛋白酶降低日粮蛋白含量对改善环境的影响，发现使用蛋白酶 可以显著降低畜牧生产中的氮排放。 根据上述酸性蛋白酶的研究进展可知，目前的酸性蛋白酶发展趋势良好，市场需 求大，生产技术逐步优化。但分析发现，依旧存在如下问题： 1 .在应用效果及优化工艺上，酸性蛋白酶酶活依旧有较大上升空间，可以进一步 提高酶解效率。 2.酶制剂的酶蛋白检测方法成熟，但应用相对单一，通常是针对某种蛋白质进行 分析。处理蛋白组分多、分离提纯难度大的固体发酵产物，此种方法不适宜，需要找到更适 合的方法。 3.目前未找到对固体发酵酸性蛋白酶的酶系进行系统研究的报道，模糊不清的粗 放生产对后续深入研究菌种、多酶相互作用、优化发酵工艺思路的拓宽等均有不利影响。 4.基于发酵饲料的原料越来越趋向于麸皮、秸秆、棉粕等农业残渣，酶制剂中的酶 系需与发酵原料的复杂结构相对应，才能起到良好的酶解效果。单酶或组和酶酶系与发酵 原料的复杂结构的对应性较差，酶解效率受抑制。 5.液体发酵工艺成熟、过程可控，是一种可行的生产酶制剂的发酵工艺。但后续的 分离纯化、冷冻干燥等后处理过程耗能大，对设备有较高要求，对厂家成本要求高。且液体 发酵的产物较固态发酵少，酶系丰富程度低于固体发酵。 5 CN 111593036 A 说 明 书 3/12 页
技术实现要素：
本发明提出一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备及其菌株和应用，以解决上述 技术问题。 本发明的技术方案是这样实现的： 一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其中， 所述菌株为黑曲霉(Aspergilus niger)BAK200389，保藏号CGMCC No.19613； 培养得到以酸性蛋白酶为主，果胶酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、 葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、阿魏酸酯酶、羧肽酶、磷酸酶多种伴生酶为辅的富含 天然复杂酶类的多酶系酸性蛋白酶制剂。 在一些实施例中，所述酶制剂的制备包括：一级斜面培养、二级液体种子制备、三 级液体种子制备、扩大培养一级固体培养； 其中，(1)一级斜面培养 将菌种黑曲霉(Aspergilus niger)BAK200389接种至土豆汁葡萄糖斜面培养基 上，28℃～31℃培养5～7d，得到萌发孢子的斜面； (2)二级液体种子制备 取步骤(1)中斜面上的孢子菌丝混合物，接种至摇瓶中的液态培养基，摇床震荡培 养；瓶内种子菌液呈粘稠状后终止培养，冷藏保存； (3)三级液体种子制备 将步骤(2)中培养好的摇瓶打开，取液态种子接种至三级摇瓶中的液态培养基，摇 床震荡培养； (4)扩大培养 发酵罐内注入液态培养基，进行高压蒸汽灭菌60～80min；停止灭菌后温度降至20 ～35℃并保持；取步骤(3)中已培养好的液态种子，通过灭菌发酵罐口快速倒入发酵罐中， 通无菌空气，搅拌培养； (5)固体培养基的接种培养 将步骤(4)中培养好的液态培养基按5％～15％的重量比放入固体发酵培养基中， 将固体发酵培养基混合均匀后，静置发酵培养；相对湿度80～90％，料温28℃～35℃，发酵 周期3～5d； 固体发酵培养基按下述比例配制：麸皮85～95％，豆粕粉5～15％，硫酸铵0.5～ 1.5％，初始水分40～55％，pH自然。 在一些实施例中，所述液态培养基按下述重量比例配制(％)：麦芽糊精4 .0～ 8.0％，葡萄糖2.0～3.5％，蛋白胨0.5～2.0％，细麸皮1.0～3.0％，pH自然。 在一些实施例中，所述摇床震荡培养条件：28℃～30℃，转速180～220r，培养周期 1～3d；所述的固体发酵培养基的灭菌要求：121℃，0.1MPa，40～60min；所述的冷藏保存的 条件：4℃，5～8d。 在一些实施例中，所述发酵罐培养的要求：27℃～32℃，搅拌转速150～200r，培养 周期1～3d；所述发酵罐的灭菌要求：121℃，0.1MPa，60～80min； 所述发酵罐罐口的灭菌要求：接种操作前酒精火圈灼烧3～5min，接种期间保持火 不灭，接种完毕后关闭罐口，火圈撤离并熄灭。 6 CN 111593036 A 说 明 书 4/12 页 在一些实施例中，还包括发酵产物的烘干步骤和粉碎步骤；其中，烘干至含水量5 ～15％停止。 本发明还提供了一种黑曲霉(Aspergilus niger)，命名为黑曲霉BAK200389，其保 藏号为CGMCC No.19613。 本发明还提供了一种畜禽饲料，包括上述黑曲霉BAK200389的培养产物。 本发明相比于现有技术具有以下有益效果： (1)本发明产出的酶之间具有很好的补充和配合作用，对裂解植物细胞壁中的大 分子化学键、松散致密有序的空间结构、生成多种有益代谢产物具有重要的协同作用。 (2)本发明所用菌株，可一菌产多酶，具有生长稳定、产酶种类较多、安全的特性。 (3)本发明提供的酸性蛋白酶酶制剂，产酶经特定底物诱导更具有针对性，拥有7 大类、38种酶蛋白。代表酶系包括：酸性蛋白酶、果胶酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露 聚糖酶、葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、阿魏酸酯酶、羧肽酶、磷酸酶等。 (4)本发明提供的多酶系酸性蛋白酶酶活可观。根据相关国家标准检测，日常保持 在9-11万，最高可达12万左右，高于已知饲料酸性蛋白酶生产酶活。目前市面销售的酸性蛋 白酶，均为液体发酵浓缩干燥而成，常规酶活为50000U/g，有少部分10万U/g或20万U/g，固 体发酵酸性蛋白酶酶活在3-5万U/g左右。 (5)本发明中，采用现代固体发酵工艺和蛋白质组学检测理论的组合模式，以现代 固体发酵理论指导下的生产工艺为基础：针对性底物诱导发酵，通过呼吸袋静置发酵，发酵 期间较严格控制培养参数；以蛋白质组学检测方法进行研究：高效率检测酶制剂中的所有 酶蛋白及有益于禽畜的代谢产物，依据检测结果可对固体发酵的各类优化进行针对性调 整，两者相辅相成。 与传统的固液发酵工艺、检测单一或少量蛋白酶的检测方法相比，操作更简单，卫 生指标有了改善，研究方向更全面深入，功能更明确，对后续各方面的优化的指导意义更直 接。 (6)本发明提供的多酶系酸性蛋白酶具有很强的稳定性，可以避免在运输、加工、 贮存过程中的酶活损失。 (7)本发明提供的多酶系酸性蛋白酶制剂可作为饲料添加剂添加到大部分禽畜的 基础日粮中，包括但不限制于鸡，鸭，猪，兔子等禽畜。具有刺激免疫，提高机体健康水平等 作用。 (8)本发明提供的多酶系酸性蛋白酶制剂可有效促进禽畜生产性能的提高，减少 养殖成本的同时，增加收入。 (9)本发明的酸性蛋白酶工艺环保，耗能低，利用农业和工业残渣为生产原料，成 本低，且工艺简单，较其他发酵方式更绿色环保。
