技术摘要：
本发明公开了一种识别特异性标记物地区适用性的评价方法，包括步骤：S1：采集样品，并提取DNA；S2：选取特异性引物；S3：制作qPCR反应和标准曲线；S4：选择灵敏度、特异性、源强特征、25th/75th阈值、目标源25th/75th作为评价引物适用性的指标，并计算各个指标的值；S5  全部
背景技术：
人和动物的粪便中含有多种病原微生物和肠道病毒，未经处理(或未完全处理)粪 便排放至自然水体中不但造成了严重的水体微生物污染，对人类的身体健康也带来了极大 的风险。例如，中国多地区每年都会有诺如病毒性肠胃炎病例报导的出现，主要传播途径就 是“粪-口”传播。而2019年末爆发的新型冠状病毒(2019-nCoV)疫情也有通过“粪-口”传播 的可能性。因此，如何快速、准确的识别微生物污染来源并评价各自污染源的贡献率成为有 效开展针对性源头控制，降低微生物污染风险的关键环节。 粪大肠菌群和大肠埃希氏菌等指示微生物作为反映水体微生物污染状况的传统 指标已被世界各国沿用多年，中国的地表水环境质量标准(GB3838-2002)也采用粪大肠菌 群制定了相应的水质评价标准。然而，传统指示微生物广泛存在于各类动物肠道中，仅能反 映出自然水体的粪便污染水平，不能识别粪便污染的来源，更不能解析各污染源的贡献率。 由于缺乏微生物污染源的准确信息，使得水体微生物污染的防治仍停留在“见污治污”的被 动模式中，不但增加了污染治理的成本，在预防介水性疾病传播方面也困难重重。针对以上 问题，欧、美等发达国家近年来开发出以宿主特异性生物标记为基础的微生物污染源解析 技术，并以不同宿主体内拟杆菌、噬菌体等微生物序列的特异性片段为靶序列设计出人、 猪、反刍动物、禽类等多种动物的特异性引物，为水体微生物污染的针对性治理提供了有效 的信息。 然而，由于不同地区的饮食习惯、气候及生活方式等存在差异，导致各类宿主体内 的肠道微生物组成和结构普遍表现出区域变异性。因此，同一引物在不同地区的特性表现 可能存在很大差异。在目标研究区域预先验证各引物的适用性和有效性成为了水体微生物 污染源解析工作的重要环节。以往对于引物的适用性评价通常采用灵敏度与特异性这两项 指标，但此两类评价因子仅能对引物特性进行定性分析，难以反映引物在不同地域的表达 水平，导致在实际应用过程中可能因各引物检出浓度的差异而无法量化不同宿主来源的微 生物污染。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种识别特异性标记物 地区适用性的评价方法，该方法结合引物的定性评价因子和源强特征等定量指标，建立较 为全面的引物适用性评价方法，可有效筛选出既具有特异性优势，且兼顾检出水平较高、检 出浓度较为稳定的宿主特异性标记物用于后续的水体微生物污染定量源解析工作。 本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种识别特异性标记物地区适用性的评 价方法，包括步骤： 5 CN 111549105 A 说　明　书 2/12 页 S1：采集样品，并提取DNA； S2：选取特异性引物； S3：制作qPCR反应和标准曲线； S4：选择灵敏度、特异性、源强特征、25th/75th阈值、目标源25th/75th作为评价引 物适用性的指标，并计算各个指标的值； S5：利用层次分析法对引物灵敏度、特异性、源强特征、25th/75th阈值、目标源 25th/75th五类参数指标进行定权，以得到各引物的综合适应性评价。 优选的，步骤S1中，DNA提取的方法是：采用粪便基因组提取试剂盒，每份粪便混匀 后称取一定量放入灭菌离心管中，进而按照试剂盒说明书进行DNA提取。提取的DNA通过超 微量分光光度计测定质量后置于-20℃冰箱储存。 优选的，步骤S3中，在选取特异性引物后，以不同人和动物的粪便样本DNA为模板， 对选取的各类宿主特异性引物进行扩增；为构建标准品，对各特异性引物采用对应的样本 DNA进行PCR扩增，扩增后的目标产物通过DNA纯化试剂盒进行纯化回收； 回收后的噬菌体引物扩增产物连接到 载体上，其它回收产物连接到pMD  19-T  Vector载体上，连接完成后，均转化至DH5α感受态细胞，采用氨苄抗生素含量为1: 1000的平板培养基筛取阳性克隆，并提取质粒DNA，同时测定相应的DNA浓度，计算目的片段 拷贝数；制备的质粒均进行10倍梯度稀释，稀释为10-0,10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6  7个梯 度；以各梯度质粒为模板，每个梯度设置3个重复，进行qPCR扩增，通过反应获得的Cq值构建 相应的标准曲线，各标准曲线的相关系数(R2)均大于0.97，且扩增效率在90-110％之间，表 明各标准曲线合格。 进一步的，qPCR扩增包括荧光染料和荧光探针两种方法。 优选的，步骤S4中，灵敏度与特异性通过采用各引物的最低定量限为阈值对扩增 结果中的阳性、阴性反应进行统计，进而计算得到。 优选的，步骤S4中，源强特征、25th/75th阈值、目标源25th/75th属于定量分析指 标，是基于各引物针对目标源和非目标源的检测浓度计算得到。 优选的，步骤S5中，利用层次分析法对五类参数指标进行定权，得到各引物的综合 适应性评价，方法是： S5.1：建立层次递阶结构，从最高层到最底层依次是目标层A、准则层B和变量层C， 目标层A是进行引物的适应性评价；准则层B是指用于表征适应性的五类参数指标，变量层C 是指候选引物，即待评价的引物； S5.2：对准则层B构建判断矩阵：依据灵敏度、特异性、源强特征、25th/75th阈值、 目标源25th/75th五类参数指标两两之间的重要程度比较，构建判断矩阵； S5.3：计算准则层B构建的判断矩阵的最大特征值及对应特征根； S5.4：对判断矩阵进行一致性检验； S5.5：若步骤S5.3的计算结果通过一致性检验，则将计算结果作为确定的最大特 征值及对应特征根，其中最大特征值对应的特征根即为目标层A对准则层B五类参数指标的 相对权重； S5.6：计算在准则层B各指标下变量层C各引物的得分，即对实验获得的变量层C各 引物在各准则层B参数指标下的引物特性表征值进行标准化； 6 CN 111549105 A 说　明　书 3/12 页 S5.7：对变量层C各引物在准则层B各参数评价指标下的得分情况进行加权，权重 为目标层A到准则层B的权重，得到各引物适应性综合得分。 更进一步的，步骤S5.3中，采用方根法计算判断矩阵的最大特征值和其对应的特 征根，步骤如下： S5.3.1、计算判断矩阵每行所有元素的几何平均值： 得到 表示各行平均值组成的向量，j表示判断矩阵的 第j列，aij表示判断矩阵的第i行第j列的元素，i表示判断矩阵的第i行； S5.3.2、将 归一化，即计算： 得到 即为最大特征值对应的特征根，这也是目标层A对 准则层B五类参数指标的相对权重ω； S5.3.3、计算判断矩阵的最大特征值： 其中 为向量Aω的第i个元素，A表示判断矩阵。 更进一步的，步骤S5.4中，对判断矩阵进行一致性检验，方法是引入随机一致性比 率CR，计算公式如下： 式中：p为判断矩阵阶数，CI为一致性指标，CR为随机一致性比率，RI为随机一致性 指标，若CR<0.1，判断矩阵具有很好一致性，判断合理；若CR＝0.1，判断矩阵具有较好一致 性，判断较合理；若CR>0.1，判断矩阵不符合一致性原则，需重新调整。 更进一步的，步骤S5.6中，对于实验引物特性表征值越大则引物适应性越佳的参 数指标，标准化公式如下： 7 CN 111549105 A 说　明　书 4/12 页 对于实验引物特性表征值越大则引物适应性越差的参数指标，标准化公式如下： 其中，xij指的是第i种引物在第j个参数指标下的未经标准化的实验得分情况，yij 指的是第i种引物在第j个参数指标下的标准化后的实验得分情况。 本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果： 本发明中将以往的引物适用性评价指标进行了改进，并建立了新的评价方法。由 于改进后的评价方法增加了定量分析指标，使得评价指标得到了完善。同时通过确定各指 标在评价体系中的权重，使得引物的地区适用性能够得到更为准确、全面的评估，可以更为 直观的了解引物在不同地区的表现。通过本发明筛选出的引物可精准识别环境水体中的微 生物污染来源及其贡献率。 附图说明 图1是本实施例中样品采集城市示意图。 图2(a)是人源特异性引物检出浓度分布图。 图2(b)是非人源特异性引物检出浓度分布图。 图3是本实施例方法的流程图。