技术摘要：
一种用于软骨修复的改良AMIC的生物3d打印的活性生物膜，其特征在于：该生物膜以海藻酸钠/明胶/透明质酸为原料制备混合水凝胶，水凝胶中混入软骨前体细胞及纤连蛋白(fibronectin)，利用沉积式生物3D打印技术构建出多孔水凝胶生物膜，通过氯化钙浸泡实现化学交联增强力学  全部
背景技术：
关节的透明软骨因为缺乏血管、神经、淋巴的支配，一旦出现损伤很难实现自愈且 容易发展为退行性疾病，临床现有的治疗技术如骨软骨移植、自体软骨细胞移植、微骨折技 术及AMIC技术等修复效果有限且长期疗效不佳。近年来，组织工程技术及生物3d打印技术 正逐渐成为新一代的软骨修复技术。3d打印技术可精确控制支架的内部结构，构建类似于 软骨形态结构、同时控制内在孔径大小根据软骨缺损实现定制化。生物3d打印技术还可实 验含细胞打印或者活性细胞因子打印，为构建体内移植物等提供了新的方向。而水凝胶作 为沉积式打印运用最多的材料拥有诸多优点如与人体软组织相似的结构和含水量多、生物 相容性好等，近年来来基于水凝胶的生物3d打印方面也有诸多进展，但是种子细胞、生长因 子的选择，同种异体细胞移植后的免疫排斥反应等以及是否长期疗效仍待观察。 微骨折技术是一种利用骨面钻孔使得含有间充质干细胞的骨髓血渗出从而修复 软骨的技术，一般利用关节镜技术将软骨受损部位移除，接下来在骨头上钻几个洞，使骨髓 细胞与血液会凝结，成为平滑且坚固的修复组织，代替软骨的作用，是治疗膝关节全层软骨 缺损的一种安全有效的方法。但因为重生基本上为纤维软骨，而关节表面本身为透明软骨， 对于较年长的患者、体重过重的患者以及软骨缺损超过2.5厘米的患者效果较差，同时缺乏 长期疗效。故临床上提出微骨折改良技术即AMIC技术(自体基质诱导软骨再生)，在微骨折 的基础上，用生物蛋白胶fibrin  glue(Tissucol；Baxter)将I/III型胶原膜(Chondro- Gide；Geistlich  Pharma  AG)粘在软骨缺损处。该方法相比微骨折技术可有效迅速缓解疼 痛、关节功能的恢复、成功的恢复运动功能且有相对长期的疗效。但是AMIC技术仍然无法完 全修复软骨缺损，且产生类似与原生的透明软骨仍是一个亟待解决的问题。 沉积式生物3d打印技术可以通过实现生长因子、细胞和水凝胶的共同打印赋予支 架生物活性，从而制备出有生物活性的支架用于软骨修复。海藻酸钠作为一种天然多糖，其 来源广泛、价格低廉，同时组织相容性和生物降解性好，海藻酸钠遇到钙离子可迅速发生离 子交换交联生成凝胶，故海藻酸钠水凝胶已广泛用于软骨组织的3d打印。明胶作为一类蛋 白质，具有高温溶解低温成胶的性能，可显著改善水凝胶的粘度改善打印性能。明胶是胶原 部分水解而得到的一类蛋白质，明胶与胶原具有同源性，而胶原作为关节透明软骨的主要 构成，因其生物相容性好、有促成软骨能力，故明胶也被广泛用于软骨的3d打印。透明质酸 (HA)是广泛存在于人及动物结缔组织中的酸性粘多糖类大分子物质，它对细胞的多种生理 功能及其调节组织形成过程中的细胞聚集，同时有用明显的促成软骨能力，表明了其在软 骨组织工程的应用价值。 软骨前体细胞(CPC)的发现为软骨修复提供了新的线索。在正常软骨中存在一种 4 CN 111588908 A 说　明　书 2/10 页 有干细胞特性的软骨前体细胞，并且有克隆和潜在分化能力。软骨前体细胞可通过纤连蛋 白粘连分离，拥有与干细胞的自我克隆增殖相似的特性，是位于软骨组织内的原始细胞，有 自我增殖能力，并有向软骨分化的潜能。纤连蛋白(fibronectin)是一种高分子量(450kDa) 的糖蛋白。fibronectin可以促进细胞-细胞和细胞-底物的粘附和细胞的迁移，所有这些都 是维持细胞结构和功能所必需的。fibronectin可剂量依赖性的增加软骨细胞的迁移和细 胞代谢率，从而增加蛋白质、RNA和DNA的合成，而CPC比软骨细胞对fibronectin的粘附能力 更强，这表明fibronectin对于CPC的激活和软骨形成更加有益。 对于大范围的距骨骨软骨损伤目前较普遍采用的方法是病灶清除后采用同种异 体骨移植，取异体骨时人为目测截除的受体距骨病灶的三维立体几何形状从异体距骨上截 取相应部分作修复重建，此方法带有较强的主观性和不准确性，而且距骨形态不规则，每个 人的距骨大小形态弧度等并不相同，取得的异体骨不能与受体距骨进行精确的匹配重建， 容易出现切取的异体骨与受体距骨的大小形态弧度不一致关节面不平整的情况，导致术后 关节内应力异常、骨性关节炎等，出现疗效不佳或手术失败，因此，需要一种能够精确修复 的软骨3D打印机。
技术实现要素：
本发明的目的是在于改善现有的AMIC技术的缺点和不足，运用生物3d打印技术制 备改良AMIC的活性生物膜，实现更佳的软骨损伤修复效果。 为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：先用海藻酸钠、明胶、透明质酸为 原料制备混合水凝胶，随后在水凝胶中混入软骨前体细胞及纤连蛋白(fibronectin)，利用 沉积式生物3D打印技术构建出多孔水凝胶生物膜，通过氯化钙浸泡实现化学交联增强力学 性能。 一种用于软骨修复的改良AMIC的生物3d打印的活性生物膜，其特征在于：该生物 膜以海藻酸钠/明胶/透明质酸为原料制备混合水凝胶，水凝胶中混入软骨前体细胞及纤连 蛋白(fibronectin)，利用沉积式生物3D打印技术构建出多孔水凝胶生物膜，通过氯化钙浸 泡实现化学交联增强力学性能。 一种用于软骨修复的生物3d打印的改良AMIC的活性生物膜的制备方法，其特征在 于，包括以下步骤： 步骤1)打印材料制备； 步骤2)打印水凝胶的配置； 步骤3)水凝胶活性生物膜的打印和后处理： 将所述步骤2)中生物墨水预处理10min成可适合果冻状凝胶态，装有生物墨水的 打印针筒转移到3d打印机中，将打印机喷头的温度和打印机平台的温度设置好后。开启气 压，调节好生物膜的相关参数，待喷嘴稳定挤出水凝胶微丝后开始打印。打印结束后用氯化 钙溶液充分固化水凝胶薄膜支架，最终得到载细胞的水凝胶薄膜支架。 所述步骤1)打印材料制备包括如下步骤： 步骤1.1)无菌处理：明胶、海藻酸钠、透明质酸、氯化钙粉末紫外消毒24h，磁力加 热搅拌器放置超净台配制水凝胶预配液。其余等所有操作均在超净台操作。 步骤1.2)明胶溶液的制备：将20ml去离子水将2.5g明胶48℃水浴加热,使用恒温 5 CN 111588908 A 说　明　书 3/10 页 磁力搅拌机搅拌，转速调节为300r/min,让其充分溶解配制成明胶溶液。 步骤1.3)海藻酸钠/明胶溶液的制备：向明胶溶液中加入20ml去离子水，1.25g海 藻酸钠，48℃水浴加热，转速为300r/min，使其充分溶解成海藻酸钠/明胶溶液。 步骤1.4)海藻酸钠/明胶/透明质酸混合溶液的制备：向海藻酸钠/明胶溶液加入 10ml去离子水，0.1g透明质酸，48℃水浴加热，转速为300r/min，使其充分溶解，使其充分溶 解均匀海藻酸钠/明胶/透明质酸溶液，最终海藻酸钠浓度为10％(w/v)，透明质酸的浓度为 0.1％(w/v)，明胶浓度为5％(w/v)；至于室温下储存，备用。 步骤1.5)将软骨细胞消化后，加入到正常含10％血清、1％双抗的软骨培养基中， 再将软骨细胞悬浮液加入到提前制备的fibronectin包被的10cm的培养皿中，吸附20min后 弃除培养基，吸附于培养皿底部的即为软骨前体细胞，正常置于二氧化碳浓度为5％，温度 为37摄氏度的细胞培养箱中备用。本发明中所述的软骨前体细胞为正常培养3代后的软骨 前体细胞。 步骤1.6)fibronectin纤连蛋白冻干粉用培养基稀释，涡旋充分溶解，制备成100μ g/ml的溶液，-20摄氏度储存备用。 所述步骤2)打印水凝胶的配置包括如下步骤： 步骤2.1)将2ml浓度为100μg/ml的fibronectin溶液、2ml细胞浓度为5x106cells/ ml细胞悬液与6ml的海藻酸钠/明胶/透明质酸水凝胶预配液混合搅拌均匀，最终海藻酸钠 浓度为2.5％(w/v)，透明质酸的浓度为0.1％(w/v)，明胶浓度为5％(w/v)，细胞浓度为 106cells/ml、fibronectin浓度为20μg/ml的海藻酸钠/明胶/透明质酸生物墨水10ml； 步骤2.2)将充分溶解均匀的海藻酸钠/明胶/透明质酸溶液倒入打印针筒离心消 泡。 在步骤1.2)、步骤1.3)、步骤1.4)中，所述的明胶(sigma)用量为0.5g、海藻酸钠 (阿拉丁)用量为0.25g、透明质酸(麦克林)用量为0.02g，三者配比为100:25:2。 在步骤3)中，所述的氯化钙(Solarbio)溶液浓度为4％(w/v)，固话交联时间为 40s。 在步骤3)中，所述的针筒温度设定为35摄氏度，平台温度设定为5摄氏度。 在步骤3)中，所述的活性生物膜的形状和尺寸可以根据实际需要进行设计，所述 的支架内部结构为打印支架的高度为0.11mm，长*宽＝2.2mm*2.2mm，每层层高为0.18mm。 在步骤3)中所述的挤出压力为8kpa，喷嘴距离地板表面0.2mm，喷嘴规格为20G，移 动速度为360mm/min。 在步骤3)中所述挤出式生物3D打印机为EFL-BP6601。 本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果： 1 .本发明所用材料均为天然材料，免疫原性低，生物相容性好，来源广泛，同时具 有一定的力学性能可为软骨再生提供良好的支撑。 2.就制备方法而言，本发明用3d打印的生物膜代替传统方法制备的I/III胶原膜， 一方面3d打印可精确控制膜的孔隙、空隙率、结构等，300-500微米的空隙可促进软骨再生， 同时优秀的孔隙率结构等也可促进细胞间的物质交换、沟通，有利于细胞因子或细胞的粘 附，有利于细胞在其内部生长和增殖。且可以根据患者的软骨受损的实际情况造模，真正的 实现个性化的治疗。 6 CN 111588908 A 说　明　书 4/10 页 3.就制备材料而言，本发明用海藻酸钠、明胶、透明质酸混合制备的生物膜代替I/ III胶原膜。海藻酸钠作为一种天然多糖，组织相容性和生物降解性好，海藻酸钠遇到钙离 子可迅速发生离子交换交联生成凝胶，故海藻酸钠水凝胶已广泛用于软骨组织的3d打印。 明胶作为一类蛋白质，具有高温溶解低温成胶的性能，可显著改善水凝胶的粘度改善打印 性能。明胶是胶原部分水解而得到的一类蛋白质，明胶与胶原具有同源性，而胶原作为关节 透明软骨的主要构成，生物相容性好、有明显的促成软骨能力。透明质酸(HA)是广泛存在于 人及动物结缔组织中的酸性粘多糖类大分子物质，它对细胞的多种生理功能及其调节组织 形成过程中的细胞聚集，同时有用明显的促成软骨能力。相对于单一的胶原膜有明显的成 软骨促进效果。 4.本发明在混合水凝胶中混入软骨前体细胞和fibronectin，制备活性的生物膜 改良AMIC技术，(1)fibronectin对于软骨前体细胞及骨髓间充质干细胞都有明显的促增 殖、成软骨分化效果。(2)存在于膜中的软骨前体细胞与释放出骨髓间充质干细胞共生长可 促进骨髓间充质干细胞成软骨分化。(3)膜的软骨前体细胞可以有效的向软骨细胞分化，促 进软骨修复效果。总的而言，本发明的改良AMIC制备的生物膜相比于无活性的单一材料的 胶原膜而言有明显改善的软骨修复效果。 5、本发明提供了一种用于软骨修复的生物3D打印的基于海藻酸钠/明胶/透明质 酸混合水凝胶合并软骨前体细胞及纤连蛋白(fibronectin)的活性生物膜及其制备方法， 用于改良临床上已使用的自体基质诱导软骨再生(AMIC)技术。该生物膜以海藻酸钠、明胶、 透明质酸为水凝胶基本材料，同时在水凝胶制备完成后混入成熟第三代软骨前体细胞及 fibronectin，利用沉积式生物3d打印技术构建多孔的水凝胶生物膜，通过氯化钙浸泡进一 步交联增加力学性能。用此生物膜替代临床上已使用的胶原膜collagen  I/III  bilayer  matrix(Chondro-Gide；Geistlich  Pharma  AG)，即运用此生物膜结合软骨下骨的微骨折技 术。本发明活性生物膜结合了明胶、海藻酸钠和透明质酸优秀的性能，具有良好的生物相容 性、力学属性及合适的空隙及空隙率，同时加入了软骨前体细胞及纤连蛋白fibronectin提 升了软骨再生能力，可用于改良AMIC技术，修复软骨缺损。 附图说明 图1为活性生物膜3d打印过程示意图。 图2为实施例的打印大体效果图。 图3为打印大体示意图，采用明胶5％。 图4为打印大体示意图，采用明胶8％。 图5为打印大体示意图，采用明胶10％。 图6为实施例的力学测试应力应变曲线。 图7为实施例的力学测试弹性模量。 图8为实施例的扫描电镜整体示意图。 图9为实施例的扫描电镜局部区域之一示意图。 图10为实施例的扫描电镜局部区域之二示意图。 图11为实施例的流变性能测试剪切变稀示意图。 图12为实施例的流变性能测试频率扫描示意图。 7 CN 111588908 A 说　明　书 5/10 页 图13为实施例的流变性能测试温度曲线示意图。 图14为实施例的含细胞打印后体外培养7天活死染色结果示意图。 图15为本发明的制备方法流程图。 图16为本发明提出的软骨修复的生物3D打印机的结构示意图； 图17为本发明提出的软骨修复的生物3D打印机的正视图； 图18为本发明提出的软骨修复的生物3D打印机图的右视图； 图19为本发明提出的软骨修复的生物3D打印机的成型平台的正视图。 图例说明：1、成型平台；101、成型面板；102、调节装置；103、喷头移动杆；104、打印 喷头；2、背板；3、盛料装置；301、玻璃平台；302、料槽圈；303、蹦膜圈；304、料槽底板；4、剥离 装置；401、电机；402、连接头；403、导向杆；404、支撑板；405、剥离盖板；5、机身框架；6、补料 装置；601、滑台；602、生物墨水容器；603、推杆；7、DLP投影光机；8、调节滑轨；9、反光镜；10、 固定支架；11、滑槽。