技术摘要：
本发明提供了人COL1A1和/或COL1A2基因的扩增、检测突变位点用引物及其试剂盒，属于基因检测技术领域。检测人COL1A1和/或COL1A2基因DNA突变的试剂盒，包括用于检测COL1A1与COL1A2基因第1至第52外显子突变的测序引物组。采用特异性引物组，针对COL1A1和COL1A2基因的第1～  全部
背景技术：
胶原蛋白(Collagen)是一类重要的蛋白质。随着生物化学、分子生物学和细胞生 物学技术的发展，目前已发现有27种不同类型的胶原，按照被发现的先后顺序分别称为I型 胶原、II型胶原、III型胶原等。胶原通常由3条α-肽链组成，有些胶原分子的3条肽链是相同 的，有些是不同的。按照国际惯例，胶原分子的3条肽链被称为α1-链、α2-链、α3-链。如果两 种胶原相互叠加，那么在命名上附带上大写罗马数字，并用括号括起来，例如III型胶原的α 1-链，称为α1(III)，α2-链称为α2(III)。 从功能方面分类，可以将胶原划分为两组，一组胶原是成纤维胶原，另一组是非成 纤维胶原。I、II、III、IV、XXIV和XXVII型胶原都是成纤维胶原，其余的都是非成纤维胶原。 然而非成纤维胶原也可以细分为6种：①FACIT(纤维结合的胶原，具有中断的三股螺旋)族 胶原，包括IX、XII、XIV、XVI、XX和XXI；②网状结构胶原，包括IV、VIII和X型胶原；③念珠状 原纤维胶原，VI型胶原即属于这一种；④锚定原纤维或纤丝胶原，包括VII和XVII型胶原；⑤ 跨膜区胶原，包括XIII、XXIII和XXV型胶原；⑥结构尚未明确的胶原，包括XV、XVIII、XXII和 XXVI型胶原。 I型胶原蛋白由三条肽链组成，其中有两条α1-链，一条α2-链构成。在机体内分布 广泛，是皮肤、骨骼、肌腱、角膜等重要组成成分。COL1A1与COL1A2基因分别编码前α1-链与 前α2-链。COL1A1或COL1A2基因突变与诸多遗传性骨病相关，如成骨不全(osteogenesis  imperfecta，OI)，爱莱尔-当洛综合征(Ehlers-Danlos  syndrome，cvEDS)、卡菲氏病或婴儿 骨皮质增生症(Caffey  disease，infantile  cortical  hyperostosis，ICH))等。 成骨不全是一种胶原合成代谢障碍所导致的遗传性结缔组织罕见疾病。主要临床 表型包括骨质疏松和骨的脆性增加、蓝巩膜、牙本质不全，早熟性耳硬化等症状。其中，I～ IV型成骨不全是由于COL1A1或COL1A2基因突变所导致的常染色体显性遗传疾病。其中I型 临床症状较轻，患者不骨折或有少数骨折史，肢体不变形。II型患者通常在围产期死亡，是 最为严重的类型。III型患者因频繁骨折、肢体畸形、身材矮小。IV型为中等程度的成骨不 全，介于I型与III型之间，骨折次数较少，通常不引起畸形。 心脏瓣膜型EDS(Cardiac-valvular  type  Ehlers-Danlos  syndrome，cvEDS)具有 心脏瓣膜缺损，关节活动过度、皮肤弹性强，薄弱，易形成疤痕，具有腹股沟疝，胸廓畸形，关 节脱位及足部畸形等特征，该类型EDS主要是由于双等位COL1A2基因突变所致。关节松弛型 EDS(The  arthrochalasia  type  Ehlers-Danlos  syndrome，aEDS)主要特征为髋脱位，关节 松弛普遍，且多脱位或半脱位，皮肤易于拉伸。另外，组织脆性、易产生淤伤、肌肉张力降低、 后凸畸形及骨量减少等也是该病的特征。OI/EDS疾病同时具有成骨不全以及爱菜尔-当洛 6 CN 111549127 A 说　明　书 2/12 页 综合征疾病的特征，突变多多发生在I型胶原蛋白氨基端与羧基端。 卡菲氏病又名婴儿骨皮质增生症，主要是由于COL1 A1基因c .3040C＞T (p.Arg836Cys)基因突变所致。主要特征是骨质增生，骨骼异常主要影响下颌骨、肩胛骨、锁 骨以及胳膊和腿部的长骨骨干等部位，该病常发于婴儿5个月前，通常会在2周岁内症状自 动恢复正常。 COL1A1或COL1A2基因的DNA位点突变常常导致疾病的发生，因此，采用基因检测手 段了解COL1A1或COL1A2基因位点的发生突变，对疾病的辅助诊断具有重要临床意义。但是 由于COL1A1或COL1A2基因全序列十分长，缺乏有效的扩增COL1A1或COL1A2基因长片段的引 物，同时现有技术中关于COL1A1或COL1A2基因的突变位点的检测通常单一突变位点的检 测，导致检测结果不全面有遗漏的情况，且产生测定结果的准确性与特异性不高的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人COL1A1基因或人COL1A2基因扩增用引物 组，极大的避免了针对单个外显子进行扩增的多次PCR反应，减少了PCR反应数量。 本发明发明的目的还在于提供一种检测人COL1A1基因或人COL1A2基因突变位点 的引用组，确保了测定结果全面且准确，同时具有与检测片段高特异性结合能力。 本发明提供了人COL1A1基因的扩增用引物组，包括两对引物：扩增COL1A1基因1～ 25外显子与内含子的引物为核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1所示的上游引物FP1和核苷酸序如 SEQ  ID  NO.2所示的下游引物RP1；扩增COL1A1基因26～52外显子与内含子的引物为核苷酸 序列如SEQ  ID  NO.3所示的上游引物FP2与核苷酸序如SEQ  ID  NO.4所示的下游引物RP2。 本发明提供了检测人COL1A1基因的DNA突变用引物组，包括如SEQ  ID  NO .1、SEQ  ID  NO.5～SEQ  ID  NO.33所示的15对检测COL1A1基因第1至第52外显子的引物。 本发明提供了人COL1A2基因的扩增用引物组，包括三对引物：扩增COL1A2基因1～ 12外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQ  ID  NO.34所示的上游引物FP18和核苷酸序 列如SEQ  ID  NO.35所示的下游引物RP18；扩增COL1A2基因13～34外显子与内含子用引物为 核苷酸序列如SEQ  ID  NO.36所示的引物FP19和核苷酸序列如SEQ  ID  NO.37所示的下游引 物RP19；扩增COL1A2基因35～52外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQ  ID  NO.38所示 的上游引物FP20和核苷酸序列如SEQ  ID  NO.39所示的下游引物RP20。 本发明提供了检测COL1A2基因DNA突变用引物组，包括如SEQ  ID  NO .34、SEQ  ID  NO.40～SEQ  ID  NO.100所示的31对用于COL1A2基因第1至第52外显子与内含子的测序的引 物； 本发明提供了一种检测COL1A1和COL1A2基因突变位点的试剂盒，包括所述人 COL1A1基因DNA突变用引物组和所述检测COL1A2基因DNA突变用引物组。 优选的，还包括DNA测序试剂；所述DNA测序试剂包括BigDye  3 .1混合液、EDTA溶 液、无水乙醇、体积浓度75％乙醇水溶液和Hi-Di甲酰胺。 优选的，还包括权利要求1所述引物组和权利要求3所述引物组。 优选的，还包括PCR扩增试剂；所述PCR扩增试剂包括dNTP  Mix、含Mg2 的2×Phanta  Max  Buffer和DNA聚合酶。 优选的，还包括PCR产物纯化试剂；所述PCR产物纯化试剂包括SAP酶和ExoI酶。 7 CN 111549127 A 说　明　书 3/12 页 本发明提供了所述扩增COL1A1基因的引物组和所述扩增COL1A2基因的引物组在 制备检测COL1A1和COL1A2基因突变位点的试剂中的应用。 本发明提供的人COL1A1或COL1A2基因的扩增用引物组，针对COL1A1基因所覆盖的 1～25号外显子和26～52号外显子分别扩增用引物，能够扩增得到两个长片段，或针对 COL1A1基因所覆盖的1～12号外显子、13～34外显子和35～52号外显子分别设计扩增用引 物，采用设计的特异性引物能够扩增得到两个或三个长片段，极大的避免了针对单个外显 子进行扩增的多次PCR反应，减少了PCR反应数量，简化扩增操作。 本发明提供的人COL1A1或COL1A2基因的检测突变用引物组，包括如SEQ  ID  NO.1、 SEQ  ID  NO.5～SEQ  ID  NO.33所示的15对检测COL1A1基因第1至第52外显子的引物，或包括 如SEQ  ID  NO.34、SEQ  ID  NO.40～SEQ  ID  NO.100所示的31对用于COL1A2基因第1～52外显 子与内含子的测序引物。采用上述特异性引物组，针对COL1A1或COL1A2基因的DNA第1到第 52外显子进行突变检测，确保了测定结果的准确性与特异性。与传统的单一突变位点的检 测而言，扩大了检测突变范围至COL1A1外显子区所有位点，覆盖已报道的突变位点与可能 的突变位点，使检测结果更加全面准确，不会遗漏可能的突变位点。 同时，本发明提供的检测突变用引物组，与传统的通过荧光定量PCR采用探针法检 测相比，降低了检测成本，同时PCR产物通过DNA序列测定以及后续序列比对完成，其准确性 要高于荧光定量PCR。与高通量测序相比较，直接对COL1A1或COL1A2致病基因进行检测，避 免了高通量测序中因原始数据筛选、阈值设定等问题而可能出现的假阳性与假阴性问题； 同时节省了成本与人力。 同时，本发明所涉及的每对引物的扩增用PCR与测序引物的扩增条件完全一致，将 COL1A1与COL1A2分段扩增极大地减少了PCR反应数，极大简化了检测操作步骤。同时，DNA测 序中所采用的上、下游测序引物，也可用于该引物对所在基因外显子的扩增，也适用于高通 量测序位点的验证、已知突变位点或是已知外显子所在突变位点的基因检测。 本发明提供了一种检测COL1A1和COL1A2基因突变位点的试剂盒，包括所述人 COL1A1基因DNA突变用引物组和所述检测COL1A2基因DNA突变用引物组。所述检测试剂盒可 用于COL1A1与COL1A2基因DNA突变所导致的成骨不全I型、II型、III型和IV型的基因突变检 测，心脏瓣膜型与关节松弛型爱菜尔-当洛综合征、OI/EDS以及卡菲氏病等遗传性疾病的基 因检测，进而辅助临床确诊该类疾病，为骨健康与神经健康提供保障。同时还为研究COL1A1 与COL1A2基因突变与基因功能之间的关系以及基因型与表型之间的相互关系奠定基础。 附图说明 图1为全血基因组DNA不同引物对对COL1A1与COL1A2基因第1到第52外显子PCR扩 增产物的0.5％琼脂糖凝胶电泳图谱； 图2是本发明检测的23例成骨不全患者COL1A1与COL1A2基因杂合突变检测结果。