技术摘要：
本发明涉及一种提高AMEP412蛋白产量的方法及其在激发植物免疫中的应用。本发明发现了一种提高AMEP412在菌株中的表达水平和纯化效率的方法，可以提高AMEP412的表达产量，并将其应用在激发植物免疫中，提高其诱导过敏反应的功能活性，由此提高AMEP412在实际应用中的利用  全部
背景技术：
AMEP412蛋白是一种在芽孢杆菌属菌株中广泛存在的蛋白。该蛋白全长76个氨  基 酸，其相对分子质量为8.36kDa，但根据分子筛体积排阻色谱的结果，AMEP412实 际表现分 子量为40-50kDa，形成了多聚体。AMEP412中50％的氨基酸为疏水氨基酸，  但由于其形成多 聚体，能够屏蔽疏水侧面，从而能够溶解于水性溶液，存在于培养液  上清中。AMEP412具有2 个带负电的残基和12个带正电的残基，理论上净电荷为正，  属于碱性蛋白质，等电点为 10.05，但由于形成多聚体的原因，AMEP412在中性水溶  液中表现为净电荷为负，属于酸性 蛋白质，能够通过阴离子交换树脂进行分离纯化。 经研究发现，AMEP412具有蛋白激发子的功能，能够激活植物免疫系统，引发  一系 列防卫反应，如诱导植物发生过敏反应(Hypersensitive  Response，HR)、引起活  性氧爆 发、提高防御酶的表达，并减轻病原菌的侵染造成的损伤。AMEP412能够诱导  植物自身免疫 防卫体系发生作用，综合提高植物自身代谢水平，增强防御病害和自然  胁迫的能力，进而 提高作物产量和品质。AMEP412不会使病原物产生抗药性，对环境  也不会产生有害影响，具 有开发为绿色生物制剂的潜力。 要将AMEP412进行应用性开发，高效获得大量高纯度的蛋白样品是关键。这包括  两个方面的内容，一是提高蛋白质的表达水平，二是提高蛋白质的回收产率。 经研究发现，传统的重组表达方法并不适用于AMEP412蛋白。将AMEP412在大  肠杆 菌重组表达系统中进行表达，AMEP412会对大肠杆菌细胞产生毒性作用，不会获  得表达产 物。而其他重组表达系统，如芽孢杆菌重组表达系统、酵母重组表达系统、 昆虫杆状病毒重 组表达系统、哺乳动物细胞重组表达系统等等，由于表达水平低下，  也不适用于AMEP412的 表达。由此，研究如何通过野生型芽孢杆菌进行AMEP412蛋 白的高效表达是该蛋白开发利 用的关键解决途径。 AMEP412在芽孢杆菌中表达，可分泌到培养液上清中。如何能够从培养液上清中  高效回收AMEP412蛋白也是其开发利用的关键。培养液上清中有众多的杂蛋白、多肽  和小 分子物质的干扰，增加了纯化的难度，再考虑到纯化方法应尽量简化，以降低应  用成本， AMEP412的高产率回收是一个难点和重点问题。 此外，AMEP412作为植物免疫激活剂在应用环节，仍有许多未完善的因素。蛋白  制 剂一般以液体形式喷施到植物叶片上，而缓冲液的特性和组成成份会对蛋白制剂的  功能 活性发挥产生影响。这需要深入分析AMEP412的蛋白特性，明确在施用环节中影  响其功能 活性的因素，并针对性的做出改进措施，以提高蛋白质的利用效率。 3 CN 111574598 A 说　明　书 2/9 页
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种提AMEP412蛋白产量的方法，并将其应用在激发植物免  疫中，为该蛋白的开发利用打下基础。 本发明通过以下技术方案来实现： 一、一种提高AMEP412蛋白产量的方法，包括提高蛋白表达水平和回收产率两个  方面。 进一步的，使用AMEP412蛋白的高效表达菌株贝莱斯芽孢杆菌BU396进行发酵  提 高蛋白表达水平。 进一步的，使用葡萄糖作为培养基的碳源进行发酵，其用量为14g/L；使用酵母粉  作为培养基的氮源进行发酵，其用量为15.2g/L；发酵培养基的pH维持在6.89，发酵 时间为 23.84小时，培养基中氯化钠、氯化钙和硫酸锌的含量分别小于0.5g/L，培养基 中Ca3(PO4)2 的含量为2g/L。 进一步的，发酵液上清中AMEP412蛋白的浓度大于或等于3mg/mL。 进一步的，所述的提高AMEP412蛋白回收产率包括离子交换树脂和超滤膜截留2  步纯化，得到高纯度的AMEP412蛋白。 根据上述的方法，该方法包括以下步骤：第一步，使用DEAE阴离子交换树脂进  行 第一步纯化，培养液上清经过阴离子交换树脂后，使用50mM  NaCl、50mM  Tris-HCl，  pH  8.0 的缓冲溶液，进行去除杂蛋白，再使用275mM  NaCl、50mM  Tris-HCl，pH  8.0 的缓冲溶液进 行洗脱，收集蛋白样品；第二步，使用截留分子大小为30kDa的超滤膜  进行超滤，收集未通 过超滤膜的蛋白样品，即为AMEP412蛋白。 进一步的，回收纯化的AMEP412蛋白大于或等于2.5mg/mL，回收产率大于或等  于 83％。 二、根据上述的方法在激发植物免疫中的应用。 进一步的，所述的激发植物免疫为AMEP412蛋白施用到烟草叶片并引起过敏反  应。 进一步的，所述的AMEP412蛋白施用时的缓冲液pH为8-9之间，硫酸亚铁浓度  为 0.1-1mM，尿素浓度为0.1-0.2mg/mL，并加入有机硅，按照1/10000-1/5000的比例  进行稀 释。 首先寻找能够高效表达AMEP412蛋白的菌株，通过PCR检测多种芽孢杆菌中的  AMEP412基因的存在，筛选出四株BU108、B.subtilis  168、BU396、BU412进行菌株 的蛋白表 达量的比较，确定BU396为高效表达菌株。以YME培养基为基础培养基，  通过单因素试验确 定最适碳源和最适氮源种类，通过响应面试验确定氮源用量、pH和  培养时间，提高AMEP412 蛋白的表达水平。此外，也检测了培养基中无机盐对  AMEP412蛋白产量的影响。 随后对AMEP412从培养液上清中进行回收纯化，先使用DEAE阴离子交换树脂  进行 纯化，使用含有275mM  NaCl的缓冲溶液进行洗脱，再使用30kDa截留体积的超  滤膜进行纯 化，收集大于30kDa的蛋白样品，即为目的蛋白。以上两步法可从培养液  上清中高效回收 AMEP412蛋白。 最后对AMEP412蛋白激发植物免疫的施用条件进行了研究，以过敏反应活性为参  考指标，确定了施用缓冲液的pH，以及缓冲液中的添加组分(包括硫酸亚铁、尿素和  有机 4 CN 111574598 A 说　明　书 3/9 页 硅)的含量。这些施用条件有效的提高了AMEP412的功能活性，提高了利用效率。 采用上述技术方案的积极效果：本发明涉及了一种提高AMEP412蛋白表达产量与  利用效率的方法，能够高效快速的获得大量AMEP412蛋白样品，并提高了蛋白在激发  植物 免疫中的施用活性，为该蛋白的开发利用提供了技术保障。 附图说明 图1为PCR扩增检测各菌株中AMEP412编码基因的存在，1-15为不同菌株的扩  增结 果，其中1、7、10、13为阳性，分别代表菌株BU108、B.subtilis  168、BU396和  BU412； 图2为不同的碳源对AMEP412蛋白表达水平的影响； 图3为不同用量的甘露醇对AMEP412蛋白表达水平的影响； 图4为不同氮源对AMEP412蛋白表达水平的影响； 图5为不同用量的酵母浸粉对AMEP412蛋白表达水平的影响； 图6为不同的无机盐对AMEP412蛋白表达水平的影响； 图7为不同浓度的磷酸钙用量对AMEP412蛋白表达水平的影响； 图8为不同缓冲液pH对AMEP412蛋白诱导过敏反应的影响； 图9为缓冲液中不同浓度的硫酸亚铁对AMEP412蛋白诱导过敏反应的影响； 图10为缓冲液中不同浓度的尿素对AMEP412蛋白诱导过敏反应的影响； 图11为缓冲液中不同稀释度的有机硅对AMEP412蛋白诱导过敏反应的影响。