技术摘要：
大黄鱼抗菌肽piscidin 5‑like type 4及其制备方法与应用，涉及大黄鱼抗菌肽。大黄鱼抗菌肽piscidin 5 like type 4命名为Lc‑P5L4。构建Lc‑P5L4重组表达载体；将所得的重组表达载体转化宿主细胞，并对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；分离纯化所得的表达产物，获 全部
背景技术：
大黄鱼产业是我国最大的海鱼产业之一。2000年以来，大黄鱼产量占海鱼总产量 的比例一直保持稳定增长的趋势([1]Qiao Y..Sequencing and correlation analysis of miRNAand transcriptome of Larimichthys crocea infencted by Cryptocaryon irritans[D].Xiamen:Xiamen University.2016)。然而由于养殖环境的无序发展和严重污 染导致了各种疾病的爆发。特别是由刺激隐核虫引起的海洋白斑病。自2005年以来，每年都 可能导致大量大型黄花鱼死亡，造成巨大的经济损失([2]Liu Z.Y.,Xie Y.Q.,Lin X.J., Fan X .J .,2014 .Research on the Cryptocaryoniosis of marine fishes from the perspective of epidemiology in Ningde of Fujian[J] .Journal of Fujian Fisheries .36 (5) ,351-358；[3]Niu S .F ..Study on the antiparasitic characterization of piscidin-like in two sciaenoid fishes[D]；Xiamen:Xiamen university,2013)。目前，海洋白斑病的主要防治方法是化学药物，但是化学药物不仅影响 有限，而且会带来更严重的问题，如海水污染和药物残留。因此，海洋白斑病已成为大黄鱼 乃至整个海洋硬骨鱼养殖业疾病防治的重大技术难题。 抗菌肽(AMPs)作为天然免疫系统中的活性成分，其抗寄生虫活性引起关注。 Piscidins是AMPs家族的中一员，是硬骨鱼类特有的一类AMPs，最早是从杂交斑纹鲈 (Morone chrysops×M .saxatilis)的肥大细胞中分离得到([4]Silphaduang U .,Noga E .J ..2001 .Antimicrobials-Peptide antibiotics in mast cells of fish[J] .Nature.414(6861) ,268-269)。杂交斑纹鲈Piscidins2在体外具有抗寄生虫活性，可引起 刺激隐核虫幼虫肿胀、死亡、解体；小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)对Piscidins2 更敏感，可能是由于影响其活性的阳离子浓度不同([5]Colorni A.,Ullal A.,Heinisch G.,Noga E.J.,2008.Activity of the antimicrobial polypeptide piscidin 2against fish ectoparasites[J].J Fish Dis.31(6) ,423-432)。白鲈鱼Piscidins 6无抑菌活性， 但可引起收缩性囊泡肿胀、表面膜破坏、细胞膜空泡化；其对淡水纤毛虫的毒性强于海洋纤 毛虫([6]Salger S.A.,Cassady K.R.,Reading B.J.,Noga E.J.,2016.A Diverse Family of Host-Defense Peptides(Piscidins)Exhibit Specialized Anti-Bacterial and Anti-Protozoal Activities in Fishes[J] .PLOS one .11(8) ,1-25)。杂交斑纹鲈 piscidin 7也不具有任何抗菌活性，但它对海洋纤毛虫的活性高于piscidin 6。因此，某些 piscidins有独特的抗寄生虫活性。 大黄鱼(Larimichthys crocea)的piscidins-like基因(Lc-pis)不仅可以抑制或 杀死一些细菌，特别是一些水生致病菌,而且它也是一个抗虫肽(APP)，可以溶解细胞膜，导 致滋养体内容物泄漏。随后，从刺激隐核虫免疫的大黄鱼的肝脏比较转录组中发现了 3 CN 111574610 A 说 明 书 2/5 页 piscidin 5-like(Lc-P5L)和piscidin 5-like type 4，表明它们参与了刺激隐核虫感染 的防御([7]Zheng L.B.,Mao Y.,Wang J .,Chen R .N.,Su Y.Q .,Hong Y.Q.,Hong Y.J ., Hong Y .C .,2018.Excavating differentially expressed antimicrobial peptides from transcriptome of Larimichthys crocea liver in response to Cryptocaryon irritans[J].Fish&Shellfish Immunology.75,109-114)。Lc-P5L之前已经被克隆并进行 了表征([8]Zhou Q.J .,Su Y.Q.,Niu S.F .,Liu M.,Qiao Y.,Wang J .,2014.Discovery and molecular cloning of piscidin-5-like gene from the large yellow croaker (Larimichthys crocea)[J].Fish&Shellfish Immunology.41,417-420)。体外实验发现， Lc-P5L可引起刺激隐核虫滋养体的核肿胀、细胞膜破裂和内容物渗漏([9]Zheng L .B ., Hong Y .Q .,Sun K .H .,Wang J .,Hong Y .J .,2020 .Characteristics delineation of piscidin 5like from Larimichthys crocea with evidence for the potent antiparasitic activity[J].Developmental&Comparaive Immunology.Underview)。因 此，推测piscidins在对抗刺激隐核虫的过程中可能起着多种关键作用。 体外重组表达抗菌肽piscidin 5-like type 4不仅在研究大黄鱼免疫防御机制 方面具有重要意义，而且为研发抗刺激隐核虫药物提供参考依据。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5-like type 4基因的编码 序列。 本发明的第二目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5-like type 4的氨基酸序 列。 本发明的第三目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5-like type 4的制备方法。 本发明的第四目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5-like type 4的应用。 所述大黄鱼抗菌肽piscidin 5like type 4命名为Lc-P5L4。 所述Lc-P5L4基因的编码序列为： 所述Lc-P5L4的氨基酸序列为： 4 CN 111574610 A 说 明 书 3/5 页 重组piscidin 5-like type 4(rLc-P5L4)的制备方法包括以下步骤： 1)构建Lc-P5L4重组表达载体； 2)将步骤1)所得的重组表达载体转化宿主细胞，并对宿主细胞进行诱导表达，获 得表达产物； 3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即rLc-P5L4。 在步骤1)中，所述表达载体可选用pET-32a。 在步骤2)中，所述宿主细胞可选用E.coli BL21(DE3)。 在步骤3)中，可先将步骤2)所得的表达产物进行透析，再进行亲和层析。 所述rLc-P5L4对刺激隐核虫幼虫、滋养体具有明显的抑杀活性，因此所述大黄鱼 抗菌肽piscidin 5-like type 4在制备抗虫药物和作为水产养殖业中防治病害的饲料添 加剂中具有广泛的应用价值。 本发明在分离得到Lc-P5L4的基础上，根据Lc-P5L4基因序列特征成功构建重组表 达载体并在大肠杆菌系统中表达并纯化获得重组rLc-P5L4蛋白，该重组蛋白具有一定的抗 菌活性和较强的抗刺激隐核虫活性。研究结果表明，Lc-P5L4是一种重要的先天免疫因子， 广泛参与了大黄鱼的抗病原生物感染反应，因此，重组基因工程产品rLc-P5L4在抗虫新药 的开发中具有非常诱人的应用前景。 附图说明 图1为pET-32a原核表达载体构建图。 图2为SDS-PAGE分析pET-32a-Lc-P5L4重组大肠杆菌IPTG诱导表达菌体超生破碎 后分离上清与沉淀的电泳图，在图2中，M为SDS-PAGE标准蛋白质Marker，1:IPTG诱导前含重 组质粒的E.coli BL21(DE3)总细胞提取物，2为IPTG诱导的重组蛋白，3为菌体超生破碎后 沉淀，4为超声波处理后的上清液。 图3为纯化产物的western blot图。在图3中，M为SDS-PAGE标准蛋白质Marker。 图4为40μM rLc-P5L4与刺激隐核虫幼虫共孵不同时间的光镜图。在图4中，A为未 经处理的空白对照或经rTRX-His-tag处理的阴性对照。B～F为分别用rLc-P5L4处理15min (B)、30min(C)、45min(D)、1.5h(E)、2h(F)。 图5为40μM rLc-P5L4与刺激隐核虫幼虫共孵不同时间的扫描电镜图。在图5中，标 尺为10μm，A为未经处理的空白对照或经rTRX-His-tag处理的阴性对照。B～F为分别用rLc- P5L4处理15min(B)、30min(C)、45min(D)、1.5h(E)、2h(F)。 5 CN 111574610 A 说 明 书 4/5 页
大黄鱼抗菌肽piscidin 5‑like type 4及其制备方法与应用，涉及大黄鱼抗菌肽。大黄鱼抗菌肽piscidin 5 like type 4命名为Lc‑P5L4。构建Lc‑P5L4重组表达载体；将所得的重组表达载体转化宿主细胞，并对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；分离纯化所得的表达产物，获 全部
背景技术：
大黄鱼产业是我国最大的海鱼产业之一。2000年以来，大黄鱼产量占海鱼总产量 的比例一直保持稳定增长的趋势([1]Qiao Y..Sequencing and correlation analysis of miRNAand transcriptome of Larimichthys crocea infencted by Cryptocaryon irritans[D].Xiamen:Xiamen University.2016)。然而由于养殖环境的无序发展和严重污 染导致了各种疾病的爆发。特别是由刺激隐核虫引起的海洋白斑病。自2005年以来，每年都 可能导致大量大型黄花鱼死亡，造成巨大的经济损失([2]Liu Z.Y.,Xie Y.Q.,Lin X.J., Fan X .J .,2014 .Research on the Cryptocaryoniosis of marine fishes from the perspective of epidemiology in Ningde of Fujian[J] .Journal of Fujian Fisheries .36 (5) ,351-358；[3]Niu S .F ..Study on the antiparasitic characterization of piscidin-like in two sciaenoid fishes[D]；Xiamen:Xiamen university,2013)。目前，海洋白斑病的主要防治方法是化学药物，但是化学药物不仅影响 有限，而且会带来更严重的问题，如海水污染和药物残留。因此，海洋白斑病已成为大黄鱼 乃至整个海洋硬骨鱼养殖业疾病防治的重大技术难题。 抗菌肽(AMPs)作为天然免疫系统中的活性成分，其抗寄生虫活性引起关注。 Piscidins是AMPs家族的中一员，是硬骨鱼类特有的一类AMPs，最早是从杂交斑纹鲈 (Morone chrysops×M .saxatilis)的肥大细胞中分离得到([4]Silphaduang U .,Noga E .J ..2001 .Antimicrobials-Peptide antibiotics in mast cells of fish[J] .Nature.414(6861) ,268-269)。杂交斑纹鲈Piscidins2在体外具有抗寄生虫活性，可引起 刺激隐核虫幼虫肿胀、死亡、解体；小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)对Piscidins2 更敏感，可能是由于影响其活性的阳离子浓度不同([5]Colorni A.,Ullal A.,Heinisch G.,Noga E.J.,2008.Activity of the antimicrobial polypeptide piscidin 2against fish ectoparasites[J].J Fish Dis.31(6) ,423-432)。白鲈鱼Piscidins 6无抑菌活性， 但可引起收缩性囊泡肿胀、表面膜破坏、细胞膜空泡化；其对淡水纤毛虫的毒性强于海洋纤 毛虫([6]Salger S.A.,Cassady K.R.,Reading B.J.,Noga E.J.,2016.A Diverse Family of Host-Defense Peptides(Piscidins)Exhibit Specialized Anti-Bacterial and Anti-Protozoal Activities in Fishes[J] .PLOS one .11(8) ,1-25)。杂交斑纹鲈 piscidin 7也不具有任何抗菌活性，但它对海洋纤毛虫的活性高于piscidin 6。因此，某些 piscidins有独特的抗寄生虫活性。 大黄鱼(Larimichthys crocea)的piscidins-like基因(Lc-pis)不仅可以抑制或 杀死一些细菌，特别是一些水生致病菌,而且它也是一个抗虫肽(APP)，可以溶解细胞膜，导 致滋养体内容物泄漏。随后，从刺激隐核虫免疫的大黄鱼的肝脏比较转录组中发现了 3 CN 111574610 A 说 明 书 2/5 页 piscidin 5-like(Lc-P5L)和piscidin 5-like type 4，表明它们参与了刺激隐核虫感染 的防御([7]Zheng L.B.,Mao Y.,Wang J .,Chen R .N.,Su Y.Q .,Hong Y.Q.,Hong Y.J ., Hong Y .C .,2018.Excavating differentially expressed antimicrobial peptides from transcriptome of Larimichthys crocea liver in response to Cryptocaryon irritans[J].Fish&Shellfish Immunology.75,109-114)。Lc-P5L之前已经被克隆并进行 了表征([8]Zhou Q.J .,Su Y.Q.,Niu S.F .,Liu M.,Qiao Y.,Wang J .,2014.Discovery and molecular cloning of piscidin-5-like gene from the large yellow croaker (Larimichthys crocea)[J].Fish&Shellfish Immunology.41,417-420)。体外实验发现， Lc-P5L可引起刺激隐核虫滋养体的核肿胀、细胞膜破裂和内容物渗漏([9]Zheng L .B ., Hong Y .Q .,Sun K .H .,Wang J .,Hong Y .J .,2020 .Characteristics delineation of piscidin 5like from Larimichthys crocea with evidence for the potent antiparasitic activity[J].Developmental&Comparaive Immunology.Underview)。因 此，推测piscidins在对抗刺激隐核虫的过程中可能起着多种关键作用。 体外重组表达抗菌肽piscidin 5-like type 4不仅在研究大黄鱼免疫防御机制 方面具有重要意义，而且为研发抗刺激隐核虫药物提供参考依据。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5-like type 4基因的编码 序列。 本发明的第二目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5-like type 4的氨基酸序 列。 本发明的第三目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5-like type 4的制备方法。 本发明的第四目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5-like type 4的应用。 所述大黄鱼抗菌肽piscidin 5like type 4命名为Lc-P5L4。 所述Lc-P5L4基因的编码序列为： 所述Lc-P5L4的氨基酸序列为： 4 CN 111574610 A 说 明 书 3/5 页 重组piscidin 5-like type 4(rLc-P5L4)的制备方法包括以下步骤： 1)构建Lc-P5L4重组表达载体； 2)将步骤1)所得的重组表达载体转化宿主细胞，并对宿主细胞进行诱导表达，获 得表达产物； 3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即rLc-P5L4。 在步骤1)中，所述表达载体可选用pET-32a。 在步骤2)中，所述宿主细胞可选用E.coli BL21(DE3)。 在步骤3)中，可先将步骤2)所得的表达产物进行透析，再进行亲和层析。 所述rLc-P5L4对刺激隐核虫幼虫、滋养体具有明显的抑杀活性，因此所述大黄鱼 抗菌肽piscidin 5-like type 4在制备抗虫药物和作为水产养殖业中防治病害的饲料添 加剂中具有广泛的应用价值。 本发明在分离得到Lc-P5L4的基础上，根据Lc-P5L4基因序列特征成功构建重组表 达载体并在大肠杆菌系统中表达并纯化获得重组rLc-P5L4蛋白，该重组蛋白具有一定的抗 菌活性和较强的抗刺激隐核虫活性。研究结果表明，Lc-P5L4是一种重要的先天免疫因子， 广泛参与了大黄鱼的抗病原生物感染反应，因此，重组基因工程产品rLc-P5L4在抗虫新药 的开发中具有非常诱人的应用前景。 附图说明 图1为pET-32a原核表达载体构建图。 图2为SDS-PAGE分析pET-32a-Lc-P5L4重组大肠杆菌IPTG诱导表达菌体超生破碎 后分离上清与沉淀的电泳图，在图2中，M为SDS-PAGE标准蛋白质Marker，1:IPTG诱导前含重 组质粒的E.coli BL21(DE3)总细胞提取物，2为IPTG诱导的重组蛋白，3为菌体超生破碎后 沉淀，4为超声波处理后的上清液。 图3为纯化产物的western blot图。在图3中，M为SDS-PAGE标准蛋白质Marker。 图4为40μM rLc-P5L4与刺激隐核虫幼虫共孵不同时间的光镜图。在图4中，A为未 经处理的空白对照或经rTRX-His-tag处理的阴性对照。B～F为分别用rLc-P5L4处理15min (B)、30min(C)、45min(D)、1.5h(E)、2h(F)。 图5为40μM rLc-P5L4与刺激隐核虫幼虫共孵不同时间的扫描电镜图。在图5中，标 尺为10μm，A为未经处理的空白对照或经rTRX-His-tag处理的阴性对照。B～F为分别用rLc- P5L4处理15min(B)、30min(C)、45min(D)、1.5h(E)、2h(F)。 5 CN 111574610 A 说 明 书 4/5 页
