技术摘要：
本发明公开了一种基于3D打印的微元件的核酸提取系统和方法，属于核酸提取技术领域。一种基于3D打印微元件的核酸提取系统，通过3D打印技术制备具有“伞”型结构的微元件，所述微元件包括核酸结合区和手柄区；所述核酸结合区的材质包括光敏树脂和热塑性塑料。一种基于3D  全部
背景技术：
基因是遗传的主要功能单位，它们所包含的核酸碱基的特定序列能够编码生物体 功能所需的大部分蛋白质。作为基因的载体，基于核酸的体外分子检测技术，成为强大的生 物学研究工具。从生物体中提取核酸，需要将核酸从含有蛋白质、多糖和脂肪等多种生物大 分子的复杂体系中进行分离、纯化，是PCR、测序等生物学分析的先决条件。核酸提取的质 量，显著影响后续分析的准确性和灵敏度。生物样本中残留的抑制性成分(血红素、球蛋白 等成分)及分离、纯化过程中残留的有机物和盐分，是影响PCR灵敏性和分析稳健性的重要 因素。 传统的核酸的分离方法是基于有机溶剂萃取的液相分离，如Chomczynski’s法，碱 性裂解法、酚氯抽提方法、溴化乙锭-氯化钙梯度离心法等。液相分离方法虽然有效，但存在 着很大的局限性：所需样品量大、分离时间长、易受污染、降解率高。另外，液相分离方法中 有机溶剂的残留显著增加了PCR抑制剂的残留风险。为了提高提取核酸样品的纯度与浓度， 核酸的提取方法也在不断更新，目前固相萃取核酸的方法受到更多学者的青睐。固相萃取 核酸的方法主要是采用一些对核酸有结合作用的聚合物材料，在一定条件下结合核酸然后 又在适当条件下脱附，实现核酸的分离。与液相萃取方法相比，固相萃取方法减少了有机溶 剂的使用，操作相对简便，分离时间短，样品在实验过程中不易污染与降解，提取的核酸无 论是浓度还是纯度都相对较高。 固相核酸分离方法主要是基于一些对核酸有吸附作用的聚合物材料。随着磁性材 料的发展，以磁性颗粒作为核酸结合载体的磁力分离，因具备与核酸结合后能够在外加磁 场快速移动的特点，成为如今主要的核酸固相分离手段。磁力分离虽然避免传统核酸分离 过程中的繁琐离心操作，市售商业化磁力分离也通常只需要15min左右(有文献报道为 14.5min：Zou  Y,Mason  MG,Wang  Y,Wee  E,Turni  C,Blackall  PJ ,et  al.(2017)Nucleic  acid  purification  from  plants ,animals  and  microbes  in  under  30seconds .PLoS  Biol  15(11):e2003916.)，且具有下游高通量和自动化应用的前景，但是，磁力分离难以避 免多次移液操作，需要依赖多联移液器，手动操作时，容易产生误差。同时，有报道指出，磁 力分离中普遍存在颗粒材料解吸核酸困难、DNA提取效率偏低等问题，限制了磁力分离的发 展与应用。虽然有报道指出，通过将磁性纳米粒子与DNA的复合物直接作为PCR模板可以避 免这个问题，但磁性颗粒对PCR扩增过程具有强抑制作用，洗脱过程不可避免。此外，磁性纳 米颗粒固有的团聚、沉降等现象，在高通量平行处理批量样本时，在很大程度上会影响分离 过程的稳定性。磁力分离中，因为纳米颗粒沉降现象，核酸与磁性纳米颗粒不能充分结合而 影响提取产率；因为纳米颗粒团聚则可能会引起清洗不完全与杂质包裹，影响磁力分离的 提取质量。 4 CN 111607489 A 说　明　书 2/8 页 相比磁力分离，基于非磁性材料的核酸固相分离发展较为缓慢。现行非磁力固相 分离多需要通过过滤、离心、移液等繁琐操作才能将结合有核酸的非磁性固相材料从裂解 液中分离出来，相比于借助外加磁场即能快速移动并实现核酸分离的磁力分离而言，往往 需要更多、更密集的人力操作，效率和通量都较为低下，下游应用受阻，是制约非磁力固相 分离发展和应用的关键瓶颈。 3D打印技术作为近年来快速发展的界面材料构筑技术，借助其在亚毫米，微米尺 度的高加工精度的特点，能够实现灵活的结构设计、优异的成型效果的目标。
技术实现要素：
本发明利用3D打印加工精度高的优势，针对非磁力固相分离中普遍存在依赖过 滤、离心、移液等繁琐操作、通量低且难以实现自动化的瓶颈问题，本发明提供一种基于3D 打印微元件的核酸提取系统和方法。 本发明的技术方案： 一种基于3D打印微元件的核酸提取系统，所述基于3D打印微元件的核酸提取系统 为使用3D打印技术制备的具有“伞”型结构的核酸提取微元件，包括核酸结合区和手柄区， 所述核酸结合区的材质包括光敏树脂或热塑性塑料。 3D打印微元件通过软件对微元件进行结构的设计、绘制及设置，优选的，采用3D  MAX软件进行结构的设计、绘制及设置。 进一步地，上述技术方案中，所述的3D打印技术包括：FDM熔融沉积成型3D打印技 术、SLA光固化快速成型3D打印技术、DLP数码影像投射3D打印技术、SLS选择性激光烧结3D 打印技术。 进一步地，上述技术方案中，所述光敏树脂包括聚丙烯酸PAA、聚乙二醇二丙烯酸 酯PEGDA、聚碳酸酯。 进一步地，上述技术方案中，所述3D打印微元件的核酸提取系统包括一个或至少 两个单体3D打印微元件；所述的3D打印微元件由至少两个单体3D打印微元件组成时，至少 两个单体3D打印微元件远离核酸结合区的手柄区端并排连接在连接区上；优选的，将8个单 体3D打印微元件的手柄顶端通过连接区并排连接，形成如图3所示的匹配8联排管使用的特 形微元件；或者进一步，将96个或384个单体3D打印微元件的手柄区端连接、排布在连接区 上，匹配96孔板和384孔板使用。 所述单体3D打印微元件由核酸结合区和手柄区组成，核酸结合区包括a型、b型、c 型、d型、e型、f型，其中a型为圆锥体状，圆锥体底面中心位置与手柄区结合；b型为类圆锥体 状，圆锥体顶点圆滑处理，圆锥体底面中心位置与手柄区结合；c型为圆柱体状与半球体状 结合，圆柱体直径与半球体直径相同，圆柱体一端底面中心位置与手柄区结合，另一端底面 与半球体最大直径面结合；d型为半球体状，半球体最大直径面的中心位置与手柄区结合；e 型为圆柱体与圆锥体结合，圆柱体的直径与圆锥体底面直径相同，圆柱体一端中心位置与 手柄区结合，另一端与圆锥体底面结合；f型为圆柱体与类圆锥体结合，圆柱体的直径与类 圆锥体的底面直径相同，圆柱体一端中心位置与手柄区结合，另一端与类圆锥体底面结合， 类圆锥体顶点圆滑化处理。 所述核酸结合区的尺寸随匹配的目标EP管的尺寸变化，优选的，匹配0.2ml  EP管 5 CN 111607489 A 说　明　书 3/8 页 使用的微元件，核酸结合区的尺寸为：2-5mm(宽)×5-20mm(高)；匹配0.5ml  EP管使用的微 元件，核酸结合区的尺寸为：2-6mm(宽)×5-26mm(高)；匹配1.5/2ml  EP管使用的微元件，核 酸结合区3-9mm(宽)×5-35mm(高)；核酸结合区底部为半球状的圆柱体，优选的，匹配1.5/ 2ml  EP管使用的，半球状的高度为2-4mm，直径为7-8mm，圆柱体部分直径为7-8mm，高度为0- 10mm。 进一步地，上述技术方案中，所述核酸结合区的表面光滑或粗糙，且具备或不具备 微观结构；所述微观结构包括螺纹结构、凹槽结构、多孔结构、孔道结构、粗糙纹路、凸起结 构中的一种或多种结构；所述螺纹结构和凹槽结构可以设置0个或至少1个；所述粗糙纹路 可以是任意形状；所述多孔结构、孔道结构和凸起结构包括纳米尺寸、微米尺寸；凹槽结构 和凸起结构的形状可以是任何形状，包括球体、正方体、长方体、梯形或不规则形状；所述微 观结构可以分布在核酸结合区任意部位，当微观结构种类大于1个时，可以以任何方式组 合、排布。 进一步地，上述技术方案中，所述手柄区的形状包括圆柱体、立方体，所述3D打印 微元件的核酸提取系统匹配EP管使用，当3D打印微元件的核酸提取系统置于EP管内后，手 柄区露出EP管部分高度不低于3mm；优选的，匹配单个0.2-2ml离心管使用的，微元件的尺 寸：手柄b的高度为5mm-40mm；圆柱体的直径为2-5mm，长方体的长度为2-5mm，宽度为1-5mm。 所述手柄区的材质包括光敏树脂或热塑性塑料，手柄区与核酸结合区的材质相同或不同。 进一步地，上述技术方案中，所述连接区的材质可以是任意材质和任意结构，当所 述连接区为通过3D打印技术完成时，材质包括光敏树脂或热塑性塑料，和核酸结合区、手柄 区相同或不同；当所述连接区不依赖3D打印时，为可以固定、排布若干个3D单体3D打印微元 件的、有一定刚性的结构。 所述连接区、手柄区、核酸结合区通过3D打印技术一体制备或者分体制备，当为分 体制备时，通过粘合组装或者卡扣方式组装。 进一步地，上述技术方案中，所述核酸结合区上负载或不负载功能基团或颗粒材 料，所述功能基团包括氨基、羧基、羟基；所述颗粒材料包括无机颗粒材料或金属颗粒材料， 所述无机颗粒材料包括二氧化硅、二氧化钛、二氧化锰、四氧化三铁、氧化石墨烯、碳等；所 述金属颗粒材料包括金、银等。当所述核酸结合区负载功能基团或颗粒材料时，通过在核酸 结合区的材料中混合具有所述功能基团的化合物或所述颗粒材料，通过3D打印技术制备。 本发明还提供了一种基于3D打印微元件的核酸提取系统的核酸提取方法，包括如 下步骤： (1)将3D打印微元件的核酸结合区伸入含有目标核酸的溶液中，进行核酸的结合； (2)通过手持或机器持完成步骤(1)的3D打印微元件的手柄区或连接区，移动3D打 印微元件，使3D打印微元件的核酸结合区伸入清洗液中，进行核酸的清洗； (3)将完成步骤(2)的3D打印微元件取出、进行干燥； (4)通过手持或机器持将完成步骤(3)的3D打印微元件的手柄区或连接区，使3D打 印微元件的核酸结合区置入洗脱液中，进行核酸的洗脱，所得洗脱液即为目标核酸提取液。 进一步地，上述技术方案中，步骤(1)中，所述将3D打印的微元件放入含有目标核 酸的溶液中，所述目标核酸可以是RNA、基因组DNA或质粒DNA的一种或多种混合物；所述含 有目标核酸的溶液，可以是单一成分或者多成分的任意来源的任意溶液、使用裂解液对生 6 CN 111607489 A 说　明　书 4/8 页 物样本进行裂解而来的体系、或含有目标核酸的混合溶液或者单一成分溶液。 所述裂解液是指能将样本中核酸释放到溶液中的缓冲液，所述裂解液包括：CTAB 裂解液、NaHCO3裂解液、Chelex裂解液、蛋白酶K裂解液、SDS裂解液或Trizol裂解液等。所述 CTAB裂解液包括：1-3wt％的CTAB、0.5～5M  NaCl、0.01～0.05M  EDTA、0.05～0.5M  Tris- HCl、0.05～0.5％的巯基乙醇，所述NaHCO3裂解液包括：0.05-1 .00M的NaHCO3、0.5～10％ SDS，所述Chelex裂解液包括：0.5～20％的Chelex-100和0.2～5M的DTT，所述蛋白酶K裂解 液包括：20～500mmol的Tris-HCl、10～50mmol的EDTA、100～1000mmol的NaCl，0.1～10％的 SDS，和5～30μg/mL的蛋白酶K；所述SDS裂解液包括：0.5～20％的SDS，0～30μg/mL的蛋白酶 K；所述Trizol裂解液为包含Trizol的市售或者自主配置的溶液。所述裂解液中加入或不加 入RNA消化酶或者DNA消化酶，所述裂解包括震荡、混匀操作。所述裂解处理时间为1min- 24h，处理温度为-20～100℃。 所述生物样本包括动物样本或植物样本，包括血液、动植物组织或者混合物；所述 血液包括液体全血、血细胞溶液、干血斑样本；所述动物组织可以动物身体的任意部位和任 意器官；所述植物组织包括植物的任意部位的任意组分。 步骤(1)所述进行核酸的结合，具体为，将3D打印微元件的结合区伸入目标核酸的 混合溶液中，加入或不加入辅助结合溶剂，所述辅助结合溶剂包括异丙醇、无水乙醇的一种 或两者的混合溶液，所述辅助结合溶剂的体积为裂解液体积的0.6～0.8倍；结合时间为5s ～24h； 步骤(2)所述的进行核酸的清洗，进行1-5次；清洗时间为每次2s-1min； 步骤(3)所述的干燥可在室温或加热下进行，干燥时间为1min-24h； 步骤(4)所述的洗脱液是能将结合在3D打印微元件上的核酸脱离的溶液，包括水、 PBS缓冲液、TE缓冲液和下游PCR反应液；洗脱时间为5s-5min；。 发明有益效果 1.本发明首次公开了一种3D打印的微元件用于核酸提取的系统和方法，是一种非 磁力核酸固相提取技术。固相核酸分离技术中，磁力分离被普遍认为快速且具有高通量，通 常只需要15min左右。而本发明所述核酸提取方法可以获得比磁力分离更快的分离速度、更 简单的操作过程和更稳定的分离效果。利用3D打印微元件进行核酸的分离，30s内可以完成 核酸的结合与清洗，且不需要移液、离心、过滤等操作；同时，采用3D打印微元件完全不存在 因磁珠颗粒沉降、聚集等问题引起的核酸结合不充分和杂质包裹等问题，有效保障了核酸 提取的稳定性和质量；本发明突破了现行核酸固相提取中的瓶颈问题，是本发明重要的创 新点之一。 2.本发明公开的3D打印微元件的核酸提取系统具有高通量、高效率优势。当3D打 印微元件包含8个、96个、甚至384个匹配0.2mL离心管使用的单体3D打印微元件时，通过连 接区的连接、排布可以匹配8联排管、96孔板和384孔板使用，平行完成多个核酸样本的分 离，显著提高提取通量和效率，是本发明的另一个创新点。 3.本发明公开的基于3D打印微元件的核酸提取系统和方法具有自动化应用前景。 本发明方法不依赖离心、移液等繁琐操作，通过设计自动化设备代替人工，通过机器持微元 件在不同溶液之间转移，即可以实现自动化核酸提取，是本发明的另一个创新点。 4.本发明公开的基于3D打印微元件的核酸提取系统和方法具有高度的调整灵活 7 CN 111607489 A 说　明　书 5/8 页 性。首先，可以依据下游生物分子技术应用的不同需求，通过设置参数，得到不同尺寸、不同 形状的微元件，匹配不同型号、规格的离心管使用，灵活满足应用需求；其次，通过调整微元 件核酸结合区的结构设计、官能团修饰、颗粒负载等，可以调整3D打印微元件的核酸分离效 率及选择性。 5.本发明公开的基于3D打印微元件的核酸提取系统和方法，成本低、使用灵活度 高。3D打印原材料便宜、易得，打印过程方便、快速，能显著降低了经济成本；整个核酸提取 过程能够在1m2的操作环境下完成，节约空间，且不依赖电器、移液器等装备，装备需求低、 使用灵活性高。 附图说明 图1为本发明优选的3D打印微元件的结构示意图。 图2为本发明实施例1制备的微元件的结构示意图；图2(a)至图2(h)分别为3D打印 微元件1-8。 图3为本发明实施例4的3D打印特形微元件的结构示意图。 图4为本发明实施例4的琼脂凝胶电泳图；泳道1为阴性参照，泳道2-9为8例样本，M 为DL2000  marker。 图中，1、核酸结合区；2、手柄区；3、连接区。