技术摘要：
本发明涉及一种维生素K1的纯化工艺，其方法包括以下步骤：步骤1，使用C18反相硅胶柱作为填料的DAC600制备色谱柱，甲醇和乙酸乙酯混合溶液为流动相，对合成得到的VK1粗品进行层析纯化；步骤2，步骤1收获的经过反相硅胶柱层析纯化的VK1进一步用正相层析硅胶作为填料，正  全部
背景技术：
： 维生素k1，英文名Vitamin  K1，别名：植物甲萘醌；2-甲基-3-(3,7,11,15-四甲基 十六-2-烯基)-1,4-萘醌，分子式C31H46O2，分子量450.71，结构式： 维生素k1为维生素类及矿物质缺乏症用药。 维生素K1注射液是2009版国家基本药物目录品种，主要用于各种维生素K缺乏引 起的出血性疾病的治疗。在临床上应用于凝血酶过低症、维生素K1缺乏症、新生儿自然出血 症的防治以及梗阻性黄疸、胆瘘、慢性腹泻等所致出血，香豆素类、水杨酸钠等所致的低凝 血酶原血症。维生素还具有镇痛、缓解支气管痉挛的作用，对内脏平滑肌绞痛、胆管痉挛、肠 痉挛引起的绞痛有明显的效果。维生素K1还可以用于多维食品和禽畜饲料的添加剂。 维生素k1原料药为黄色至橙黄色透明粘稠的液体。无臭或几乎无臭；遇光易分解。 在氯仿、乙醚或植物油中易溶，在乙醇中略溶，在水中不溶，折光率为1.525～1.528。 2011年，国家食品药品监督管理局发布了第43期药品不良反应信息通报，表示维 生素K1注射液存在严重过敏反应，提醒医务人员和患者要关注过敏反应的风险。数据分析 显示，维生素K1注射液的安全风险除其本身外，还包括原料药中的杂质成分。 维生素K1的制备方法包括： 使用氧化银将未酯化的二氢维生素K1转化为维生素K1。 使用六硝酸联铵为催化剂对二氢维生素K1二甲醚的氧化去甲基化可制备维生素 K1。 通过氧化二氢维生素K1碱金属盐制备维生素K1的方法。 使用碱金属氢氧化物皂化二氢维生素K1单乙酸酯或单苯甲酸酯，然后使用空气氧 化。 日本专利公开(公开)212  142/1982公开了使用二乙酯代替单酯为原料。使用空气 氧化制备维生素K1方法。 日本专利公开(公开)76854/1973公开了使用氧化银、氧化铅、二氧化锰、过氧化镍 和二甲亚砜将二氢维生素K1氧化为维生素K1的方法现有方法所得到的产物，可能产生的杂 质包括：维生素K1顺式异构体杂质(杂质3)，溶剂残留，以及相关的过氧化产物或中间体， 如"β,γ-Dihydro  Vitamin  K1"(杂质2)，"Vitamin  K1  2,3-Epoxide"(杂质1)等。 对维生素K1的纯化问题是制备维生素K1原料药的难题，特别是如何去除上述杂 质，现有技术报道极少。本发明人经过研究发现采用层析法有利于安全性的提高，但如何将 其应用于工业化生产，仍需要探索。 4 CN 111574348 A 说　明　书 2/7 页 层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。层析系统由两个相组 成：一是固定相，另一是流动相。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的 理化性质存在差异，与两相发生相互作用(吸附、溶解、结合等)的能力不同，在两相中的分 配(含量比)不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。分部收集流出 液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。常用的层析方法包 括，凝胶层析，离子交换层析，高效液相层析(HPLC)，亲和层析等。 《沈阳药科大学学报》2013年第04期“维生素K1微乳剂在大鼠体内的药物动力学” 孙婷；唐丽英；徐静瑶；赵云丽；于治国等公开了大鼠血浆中维生素K1的高效液相色谱测定 法，并应用于经灌胃给予维生素K1微乳剂后的维生素K1药动学研究。方法为采用无水乙醇 一乙醚(体积比为1：3)提取的方法处理血浆样品。采用反相高效液相色谱法测定维生素K1 的血药浓度，色谱柱为ThermoC18柱(150mm×4.6mm，5p.m)，流动相为无水乙醇一水(体积比 为90：10)，流速为1.1mL·min-1，检测波长为270nm，柱温为35℃。 2005版中国药典公开了维生素K1的检测方法：照高效液相色谱法(附录Ⅴd)测定。 避光操作。色谱条件与系统适用性试验用硅胶为填充剂；以石油醚(60-90℃)-正戊醇 (2000:2.5)为流动相；检测波长为254nm。测定法取本品约20mg，精密称定.置50ml量瓶中. 用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液5ml与内标溶液1ml，置10ml量瓶中，以 流动相稀释至刻度.摇匀.取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素k1对照品适量， 精密称定，同法测定。按内标法以顺、反式异构体峰面积的和计算，即得。 本发明人对现有技术进行了研究后，找到一种适合维生素k1的层析方法。
技术实现要素：
： 本发明提供一种维生素k1原料药的纯化方法，所述方法，包括以下步骤： 步骤1，使用C18反相硅胶柱作为填料的DAC600制备色谱柱，甲醇和乙酸乙酯混合 溶液为流动相，对合成得到的VK1粗品进行层析纯化。 步骤2，步骤1收获的经过反相硅胶柱层析纯化的VK1进一步用正相层析硅胶作为 填料，正己烷为流动相，对VK1进行层析纯化。 其中，步骤1的层析条件如下： 流动相为：甲醇和乙酸乙酯，两者比例为200：85，检测波长：270nm，300nm，流速： 10L/min，上样量：5％，样品浓度：400mg/ml 步骤1的操作过程如下： 1)流动相配制 将甲醇1781kg和乙酸乙酯676kg加入反应釜并混合搅拌均匀。 2)样品配制 称取VK1粗品9.00kg，加入乙酸乙酯8.00kg搅拌溶清，将Vk1粗品的乙酸乙酯溶液 过预柱过滤以除去机械杂质和活性炭，用剩余的2.22Kg乙酸乙酯冲洗，冲洗液合并到滤液 中，搅拌下称量加入甲醇8.88kg，搅拌并保证溶液为澄清状态；一般甲醇用量会比乙酸乙酯 少(7.20Kg左右)，否则会发生浑浊；若溶液发生浑浊，则向其中加入少量乙酸乙酯即可溶清 (0.20Kg左右)；将配制好的样品溶液平均分成4份待用。 3)进针，冲柱，进针，洗脱； 5 CN 111574348 A 说　明　书 3/7 页 4)洗脱液浓缩 将所收集的洗脱液减压浓缩，蒸出溶剂，加热从30℃逐渐升温至70℃，减压真空≥ 0.095MPa，抽蒸5～10小时，检测折光率1.520～1.528之间，出料，得到VK1精制品，供正相层 析精制。 其中，步骤2的层析条件如下： 溶剂和洗脱液：正己烷填料：正相层析硅胶 活性炭 步骤2操作过程如下： 1)备柱 取硅胶，加入正己烷浸泡装入层析柱中；再在硅胶上层铺垫一层活性炭； 2)装料 VK1精制品加入正己烷溶解，打开层析柱底部料液出口，使料液进入柱中； 3)洗脱 加入正己烷洗脱液，进行洗脱。流速大约在2～3Kg/min；前洗脱无色溶液返回流动 相釜继续使用，待洗脱出黄色料液，开始收集，收集时间约2～3小时； 4)浓缩将所收集的层析液减压浓缩，得VK1纯品。 经过检测，本发明VK1纯品，各种指标如下： 采用现有方法制备得到的VK1，有关杂质含量如下：   收率 总杂含量 杂质1含量 杂质2含量 杂质3含量 样品 50％ 0.25 0.06％ 0.12％ 0.07％ 其中，现有方法为采用正相硅胶柱，流动相为3％乙酸乙酯的石油醚溶液，不加压 自然过滤洗脱，重复2次过柱分离，单次过柱耗时约10天，单次溶剂消耗每公斤原料药约 1200升。 注：其中所述含量为重量百分含量 本发明的优点： 1、反相柱采用DAC600型工业自动化制备柱，单次分离时间约30～40分钟；正相柱 采用传统的正相硅胶柱，正己烷为流动相，加压快速过滤分离，单次分离时间约2～3小时， 节省时间和人工成本； 2、反相柱流动相消耗每公斤原料药约300升，正相柱流动相消耗每公斤原料药120 升，较传统硅胶柱分离纯化大大节省了溶剂消耗。 3、反相柱和正相柱全部采用目标物段全接收方法，单次过柱收率80％以上，总收 率65％左右，操作简单，适合工业化生产。 本发明的核心技术在于步骤1，其中的层析条件是经过筛选获得的，筛选过程如 6 CN 111574348 A 说　明　书 4/7 页 下： 流动相的筛选 1、反相柱流动相可用甲醇和乙酸乙酯、乙醇和乙酸乙酯、甲醇和二氯甲烷、乙醇和 二氯甲烷等体系，其中乙醇和乙酸乙酯从分离效果和溶剂安全方面为最佳选择； 2、正相柱流动相可用石油醚、正己烷、异辛烷等烷烃类溶剂，其中正己烷效果最 佳。 色谱柱的筛选 1、反相柱为DAC600工业制备柱，填料选用C18硅胶，C18硅胶对于化物的保留能力 强于C8硅胶，适合VK1这种弱极性化合物的分离； 2、正相柱采用100到200目硅胶做为填料。 附图说明： 图1本发明实施例1所得VK1高效液相色谱图，检测方法参照药典。其中1为杂质1，2 为杂质2，3为VK1，被测样品为第一批样品1。