技术摘要：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法。本发明利用干酒糟丰富的营养组分，采用碱性蛋白酶酶解干酒糟产生的酶解液作为发酵培养基溶剂，通过控制发酵pH，流加补料以及维持溶氧量，实现了生防益生菌多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆 全部
背景技术：
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)与坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus) 是芽孢杆菌属、革兰氏阳性细菌，好氧或兼性厌氧环境下易培养，能够产生芽孢，对人及动 植物无致病性，已被多个国家或地区列为重要的生物农药与生物防治制剂。其中，多粘类芽 孢杆菌被我国列为免做安全鉴定的一级菌种，也是美国环境保护署批准的商业化应用微生 物之一，而坚强芽孢杆菌已被巴西国家卫生监督局批准作为生物杀线虫剂或种子处理剂使 用。多粘类芽孢杆菌能够分泌包括多肽类抗生素、拮抗蛋白、植物激素、酶以及胞外多糖等 在内的多种代谢活性物质，可促进植物生长、诱导植物免疫抗性以及拮抗病原微生物，但是 缺乏对农作物虫害的防治作用。坚强芽孢杆菌能够分泌抗菌蛋白(酶)类活性产物，并快速 定植植物根际，通过抑菌作用及孢子萌发能够强力杀灭根结线虫、胞囊线虫、金色线虫、异 皮线虫、畜禽肠道蛔虫等多种动植物害虫、幼虫及虫卵，但是不具备促进植物生长或免疫抗 性等方面的综合效价。因而，多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌如若作为复合菌剂施用，在生 防促生及抑菌灭虫方面将具有显著的协同互补作用，发展前景与应用价值巨大。 事实上，有效活菌数或孢子数是芽孢杆菌菌剂产品的重要指标之一，通过高密度 发酵技术可有效提高发酵活菌数或孢子数，提升生物效价，满足工业生产需要。目前，多粘 类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌研究集中在单一菌株的发酵优化及菌剂制备，但普遍存在有效 活菌数不高、发酵周期较长、培养组分复杂等问题。针对多粘类芽孢杆菌，在专利 CN102559564B中公开了一种高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，对多粘类芽孢杆菌菌株B- 306所需可溶性淀粉、蛋白胨、氯化钠、氯化钙与磷酸氢二钠以及培养pH、温度、转速及接种 量等条件进行了优化，发酵24小时后，多粘类芽孢杆菌有效活菌数由优化前3.17×108CFU/ mL提高至5.3×109CFU/mL。在专利CN106434458B中公开了一种多粘类芽孢杆菌及其菌剂和 制备与应用，采用固体发酵方式，培养基主要包括甜高粱秸秆粉，麸皮，米糠，豆粕粉，淀粉， 麦饭石，酵母粉，碳酸钙，硫酸镁，磷酸二氢钾以及硫酸锰，发酵培养72-144小时后，所制备 菌剂中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为2-4×1010CFU/g。专利CN104694446B公开了一种多粘 类芽孢杆菌JX-13及其应用，采用液体发酵方式，培养基主要包括豆粕、马铃薯淀粉、蔗糖、 酵母粉、碳酸钙以及硫酸锰，发酵条件为溶氧100％、转速350rpm、pH7.0-7.2以及温度30℃， 发酵培养36小时后，所制备菌剂中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为1×1010CFU/g。专利 CN104099278B公开了一种培养高产量多粘类芽孢杆菌的方法，培养基主要由稻壳、玉米粉、 土豆、油茶茶渣饼、磷酸氢二钾以及硫酸锰组成，36-38℃发酵培养70-74小时，所制备菌剂 中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为2.73×1010CFU/g。 针对坚强芽孢杆菌，孙静等[1-2]以豆粕为底物，对坚强芽孢杆菌PC024发酵工艺条 件进行了优化，围绕接种量、料水比、发酵时间、发酵温度进行响应面分析实验，发酵100小 3 CN 111575201 A 说 明 书 2/13 页 时后，有效活菌数可达到1.23×1010CFU/g。在专利CN108913636A中公开了一种坚强芽孢杆 菌菌粉的制备方法，培养基由玉米粉、葡萄糖、豆饼粉、鱼粉、碳酸钙、硫酸铵、磷酸氢二钾、 七水硫酸镁以及氯化钠九种成分组成，在28℃，90-110rpm，pH6-7条件下发酵培养24-36小 时。在专利CN108913636A中公开了一种抗重茬肥料，所用坚强芽孢杆菌发酵培养基包含玉 米粉、鱼粉、壳聚糖、硫酸铵、碳酸钙、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁以及消泡剂九种组分，培 养温度29-31℃，培养36-40小时后，发酵液中坚强芽孢杆菌有效活菌数可达到2×109CFU/ mL以上。在专利CN106399159B中公开了一种坚强芽孢杆菌菌剂及其制备方法与应用，所用 发酵培养基包含酵母粉、玉米淀粉、葡萄糖、氯化钙、豆粕粉及消泡剂六种组分，调节pH8.1- 8.3，温度30℃-36℃，通气量为0.5-1vvm，转速150-200rpm，发酵40-48小时后，所制备坚强 芽孢杆菌菌剂有效活菌数为1×1010-12CFU/g。 综上，现有多粘类芽孢杆菌或坚强芽孢杆菌单一菌剂制备及发酵技术主要围绕接 种量、发酵温度、pH以及培养时间进行优化，发酵培养基组分较复杂，以豆粕、玉米淀粉、葡 萄糖、鱼粉、无机盐等为主要组成，一方面有效活菌数与生产强度较低，另一方面由于发酵 结束后孢子数低，导致单一菌剂生产成本很高。因而，基于多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆 菌，开发高密度混合发酵技术，制备复合芽孢杆菌菌剂，如若提高有效活菌数，提高孢子数， 缩短发酵时间，降低菌剂制备成本，研究意义与应用价值巨大。 上述对
技术实现要素：
的陈述仅是为了方便对本发明技术方案(使用的技术手段、解决 的技术问题以及产生的技术效果等方面)的深入理解，而不应当被视为承认或以任何形式 暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法。本发明利用干酒糟丰富的营养组分，采用碱性蛋白酶酶解干酒糟产生的酶解液作为发酵培养基溶剂，通过控制发酵pH，流加补料以及维持溶氧量，实现了生防益生菌多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆 全部
背景技术：
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)与坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus) 是芽孢杆菌属、革兰氏阳性细菌，好氧或兼性厌氧环境下易培养，能够产生芽孢，对人及动 植物无致病性，已被多个国家或地区列为重要的生物农药与生物防治制剂。其中，多粘类芽 孢杆菌被我国列为免做安全鉴定的一级菌种，也是美国环境保护署批准的商业化应用微生 物之一，而坚强芽孢杆菌已被巴西国家卫生监督局批准作为生物杀线虫剂或种子处理剂使 用。多粘类芽孢杆菌能够分泌包括多肽类抗生素、拮抗蛋白、植物激素、酶以及胞外多糖等 在内的多种代谢活性物质，可促进植物生长、诱导植物免疫抗性以及拮抗病原微生物，但是 缺乏对农作物虫害的防治作用。坚强芽孢杆菌能够分泌抗菌蛋白(酶)类活性产物，并快速 定植植物根际，通过抑菌作用及孢子萌发能够强力杀灭根结线虫、胞囊线虫、金色线虫、异 皮线虫、畜禽肠道蛔虫等多种动植物害虫、幼虫及虫卵，但是不具备促进植物生长或免疫抗 性等方面的综合效价。因而，多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌如若作为复合菌剂施用，在生 防促生及抑菌灭虫方面将具有显著的协同互补作用，发展前景与应用价值巨大。 事实上，有效活菌数或孢子数是芽孢杆菌菌剂产品的重要指标之一，通过高密度 发酵技术可有效提高发酵活菌数或孢子数，提升生物效价，满足工业生产需要。目前，多粘 类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌研究集中在单一菌株的发酵优化及菌剂制备，但普遍存在有效 活菌数不高、发酵周期较长、培养组分复杂等问题。针对多粘类芽孢杆菌，在专利 CN102559564B中公开了一种高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，对多粘类芽孢杆菌菌株B- 306所需可溶性淀粉、蛋白胨、氯化钠、氯化钙与磷酸氢二钠以及培养pH、温度、转速及接种 量等条件进行了优化，发酵24小时后，多粘类芽孢杆菌有效活菌数由优化前3.17×108CFU/ mL提高至5.3×109CFU/mL。在专利CN106434458B中公开了一种多粘类芽孢杆菌及其菌剂和 制备与应用，采用固体发酵方式，培养基主要包括甜高粱秸秆粉，麸皮，米糠，豆粕粉，淀粉， 麦饭石，酵母粉，碳酸钙，硫酸镁，磷酸二氢钾以及硫酸锰，发酵培养72-144小时后，所制备 菌剂中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为2-4×1010CFU/g。专利CN104694446B公开了一种多粘 类芽孢杆菌JX-13及其应用，采用液体发酵方式，培养基主要包括豆粕、马铃薯淀粉、蔗糖、 酵母粉、碳酸钙以及硫酸锰，发酵条件为溶氧100％、转速350rpm、pH7.0-7.2以及温度30℃， 发酵培养36小时后，所制备菌剂中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为1×1010CFU/g。专利 CN104099278B公开了一种培养高产量多粘类芽孢杆菌的方法，培养基主要由稻壳、玉米粉、 土豆、油茶茶渣饼、磷酸氢二钾以及硫酸锰组成，36-38℃发酵培养70-74小时，所制备菌剂 中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为2.73×1010CFU/g。 针对坚强芽孢杆菌，孙静等[1-2]以豆粕为底物，对坚强芽孢杆菌PC024发酵工艺条 件进行了优化，围绕接种量、料水比、发酵时间、发酵温度进行响应面分析实验，发酵100小 3 CN 111575201 A 说 明 书 2/13 页 时后，有效活菌数可达到1.23×1010CFU/g。在专利CN108913636A中公开了一种坚强芽孢杆 菌菌粉的制备方法，培养基由玉米粉、葡萄糖、豆饼粉、鱼粉、碳酸钙、硫酸铵、磷酸氢二钾、 七水硫酸镁以及氯化钠九种成分组成，在28℃，90-110rpm，pH6-7条件下发酵培养24-36小 时。在专利CN108913636A中公开了一种抗重茬肥料，所用坚强芽孢杆菌发酵培养基包含玉 米粉、鱼粉、壳聚糖、硫酸铵、碳酸钙、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁以及消泡剂九种组分，培 养温度29-31℃，培养36-40小时后，发酵液中坚强芽孢杆菌有效活菌数可达到2×109CFU/ mL以上。在专利CN106399159B中公开了一种坚强芽孢杆菌菌剂及其制备方法与应用，所用 发酵培养基包含酵母粉、玉米淀粉、葡萄糖、氯化钙、豆粕粉及消泡剂六种组分，调节pH8.1- 8.3，温度30℃-36℃，通气量为0.5-1vvm，转速150-200rpm，发酵40-48小时后，所制备坚强 芽孢杆菌菌剂有效活菌数为1×1010-12CFU/g。 综上，现有多粘类芽孢杆菌或坚强芽孢杆菌单一菌剂制备及发酵技术主要围绕接 种量、发酵温度、pH以及培养时间进行优化，发酵培养基组分较复杂，以豆粕、玉米淀粉、葡 萄糖、鱼粉、无机盐等为主要组成，一方面有效活菌数与生产强度较低，另一方面由于发酵 结束后孢子数低，导致单一菌剂生产成本很高。因而，基于多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆 菌，开发高密度混合发酵技术，制备复合芽孢杆菌菌剂，如若提高有效活菌数，提高孢子数， 缩短发酵时间，降低菌剂制备成本，研究意义与应用价值巨大。 上述对
技术实现要素：
的陈述仅是为了方便对本发明技术方案(使用的技术手段、解决 的技术问题以及产生的技术效果等方面)的深入理解，而不应当被视为承认或以任何形式 暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
