技术摘要：
本发明公开了同时检测PEDV和TGEV的速测卡及其制备、使用方法。所述速测卡包括卡壳和设置在卡壳内的试纸条，试纸条包括PVC底板、依次相连地粘贴在所述PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，卡壳上设置有加样孔和结果观察窗。硝酸纤维素膜上固定有抗PEDV特  全部
背景技术：
猪流行性腹泻病毒(porcine  epidemic  diarrhea  virus，以下简称PEDV)可造成 感染猪体腹泻、呕吐、脱水，并最终导致死亡，各年龄段猪均可感染，但哺乳仔猪最为易感。 自2010年新的猪病毒性腹泻(PED)疫情爆发以来，给全球养猪业造成了严重的经济损失。研 究已证实PEDV变异株为此次疫情的元凶，且其致病力更强，可造成新生仔猪100％死亡。基 于该病毒易突变和重组的特性，目前位于亚洲、美洲和欧洲的多个国家均发生不同基因型 毒株的感染疫情，这也使得疫苗的使用效果并不理想，到目前为止无法彻底控制。 猪肠胃炎病毒(porcine  transmissible  gastroenteritis  virus，以下简称 TGEV)  与PEDV相同，同属于α-冠状病毒属，也同样造成仔猪以腹泻、脱水，甚至严重至死亡 为特征的疾病。Doyle和Hutchings首次报道了美国由TGEV引起的疾病，随后传播至各个大 陆：北美(1989年的加拿大)、欧洲(1957年的英国)和亚洲(1956年的日本、2000年的韩国和 2000年的泰国)。在中国，20世纪60 年代报道了该病，自2010年以来发生了广泛的疫情。 作为猪病毒性腹泻疾病最为重要的两种病原体，两者之间也常常存在混合感染的 情况。对于发生腹泻疫情的企业及养殖用户而言，能够及时有效地明确感染病原微生物，对 预防和控制疫情的发展起到极其重要的作用。目前常规检测  PEDV和TGEV的方法为PCR，但 该方法需要专门的实验室场地，需要借助专门的仪器设备，并且对操作人员要求较高，需要 有相当的专业知识、技能和操作经验，检测过程前处理复杂，所需时间很长。 因此，开发一种能够同时快速检测并鉴别PEDV和TGEV的技术手段对猪流行性腹泻 疾病的防控具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种同时检测PEDV和TGEV 的速测 卡，用于对猪的粪便样本中的PEDV和TGEV进行快速、现场和灵敏的检测。 本发明所提供的同时检测PEDV和TGEV的速测卡包括卡壳和设置在卡壳内的试纸 条，所述试纸条包括PVC底板、依次相连地粘贴在所述PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤 维素膜和吸收垫，所述卡壳上设置有加样孔和结果观察窗。所述硝酸纤维素膜上固定有抗 PEDV特异性单克隆抗体和抗TGEV特异性单克隆抗体用于分别形成第一检测线和第二检测 线，所述结合垫上固定有胶体金标记的抗PEDV特异性单克隆抗体和胶体金标记的抗TGEV特 异性单克隆抗体。 优选地，所述抗PEDV特异性单克隆抗体是利用2019年09月11日保藏在位于中国武 汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC  NO：  C2019170的杂交瘤细胞株 FL011-26和/或保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC  4 CN 111596064 A 说　明　书 2/8 页 NO：C2019194的杂交瘤细胞株FL011-33  制备得到的。 优选地，所述抗TGEV特异性单克隆抗体是利用2019年09月11日保藏在位于中国武 汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC  NO：  C2019195的杂交瘤细胞株 FL111-01和/或保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC  NO：C2019196的杂交瘤细胞株FL011-07  制备得到的。 优选地，所述硝酸纤维素膜上固定有利用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武 汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC  NO：C2019170 的杂交瘤细胞株FL011- 26所产生的抗PEDV特异性单克隆抗体和利用2019年  09月11日保藏在位于中国武汉武汉大 学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为  CCTCC  NO：C2019195的杂交瘤细胞株FL111-01所 制备得到的抗TGEV特异性单克隆抗体。所述结合垫上固定有胶体金标记的利用2019年09月 11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC  NO： C2019194的杂交瘤细胞株FL011-33所产生的抗PEDV特异性单克隆抗体和胶体金标记的利 用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为 CCTCC  NO：C2019196的杂交瘤细胞株FL011-07所制备得到的抗TGEV特异性单克隆抗体。 优选地，所述硝酸纤维素膜上固定的所述抗PEDV特异性单克隆抗体和所述抗TGEV 特异性单克隆抗体的量分别为0.4μg-1 .2μg，所述结合垫上固定的所述胶体金标记的抗 PEDV特异性单克隆抗体和所述胶体金标记的抗TGEV特异性单克隆抗体分别为5ng-50ng。 本发明另一方面还提供一种制备同时检测PEDV和TGEV的速测卡的方法，包括以下 步骤：(1)用抗PEDV特异性单克隆抗体在硝酸纤维素膜上进行包被固定形成第一检测线和 第二检测线中的一个，用抗TGEV特异性单克隆抗体在硝酸纤维素膜上进行包被形成所述第 一检测线和所述第二检测线中的另一个，用羊抗鼠IgG二抗在硝酸纤维素膜进行包被形成 质控线，得到含有所述第一检测线、所述第二检测线和所述质控线的硝酸纤维素膜；(2)制 备固定有胶体金标记的抗PEDV特异性单克隆抗体和胶体金标记的抗TGEV特异性单克隆抗 体的结合垫；(3)组装试纸条：在PVC底板上依次粘贴设置样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤 维素膜和吸收垫来得到所述试纸条，其中所述样品垫位于所述结合垫上方且所述结合垫与 所述样品垫具有1mm-1.5mm的重叠区，所述硝酸纤维素膜位于所述结合垫下方且所述硝酸 纤维素膜与所述结合垫具有1mm-2mm的重叠区，所述吸收垫位于所述硝酸纤维素膜的上方 且所述吸收垫与所述硝酸纤维素膜具有1mm-2mm的重叠区，所述样品垫是大小为4mm×15mm 的玻璃纤维膜；(4)  安装卡壳使得其覆盖住所述试纸条，其中所述卡壳上的加样孔位于所 述样品垫上方，所述结果观察窗位于所述硝酸纤维素膜上方使得能露出所述第一检测线、 所述第二检测线和所述质控线所在的位置。 优选地，所述抗PEDV单克隆抗体是利用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉 大学的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC  NO：C2019170 的杂交瘤细胞株FL011- 26和/或2019年09月11日保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC  NO：C2019194 的杂交瘤细胞株FL011-33制备得到的。所述抗TGEV单克隆抗体是利用2019年09月11日保藏 在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC  NO：C2019195的 杂交瘤细胞株FL111-01或2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养 物保藏中心、保藏编号为CCTCC  NO：C2019196的杂交瘤细胞株FL011-07  制备得到的。 优选地，所述硝酸纤维素膜上固定有利用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武 5 CN 111596064 A 说　明　书 3/8 页 汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC  NO：C2019170 的杂交瘤细胞株FL011- 26所产生的抗PEDV特异性单克隆抗体和利用2019年  09月11日保藏在位于中国武汉武汉大 学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为  CCTCC  NO：C2019195的杂交瘤细胞株FL111-01所 产生的抗TGEV特异性单克隆抗体。所述结合垫上固定有胶体金标记的利用2019年09月11日 保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC  NO：C2019194的杂交瘤细胞株FL011-33  所产生的抗PEDV特异性单克隆抗体和胶体金标记的利用2019年09月11日保藏在位于中国 武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC  NO：  C2019196的杂交瘤细胞株 FL011-07所产生的抗TGEV特异性单克隆抗体。 优选地，所述硝酸纤维素膜上固定的所述抗PEDV特异性单克隆抗体和所述抗TGEV 特异性单克隆抗体的量分别为0.4μg-1 .2μg，所述结合垫上固定的所述胶体金标记的抗 PEDV特异性单克隆抗体和所述胶体金标记的抗TGEV特异性单克隆抗体分别为5ng-50ng。 本发明还提供一种应用上述速测卡同时检测PEDV和TGEV的方法，其包括以下步 骤：(1)样本处理：向猪的新鲜粪便样品中加入pH  7.4、0.2mol/L的  PBS缓冲液作为提取缓 冲液，静置或离心，取上清；(2)加样：取100μL步骤  (1)中的上清液加入到所述速测卡的加 样孔中，孵育8-10min；(3)结果判定：从所述结果观察窗观察速测卡中第一检测线、第二检 测线和质控线的颜色变化，当仅有质控线显色而第一检测线和第二检测线均不显色时，判 定待检样品中  PEDV和TGEV均是阴性，当第一检测线、第二检测线和质控线均显色时，判定 待检样品中PEDV和TGEV均是阳性，当质控线以及第一检测线或第二检测线中的一个同时显 色时，判定待检样品中与第一检测线或第二检测线中显色的那道检测线所对应的病毒为阳 性。 本发明所提供的速测卡对粪便样本具有较好的抗干扰效果，可广泛应用于猪腹泻 疾病的快速检测。与现有的速测卡操作相比较，本发明的速测卡尤其具有以下优势：(1)本 发明的速测卡不是将分别针对两种病原的检测卡进行简单的物理性胶连，而是在同一张硝 酸纤维素膜上同时固定包被抗PEDV特异性单克隆抗体和抗TGEV特异性单克隆抗体，仅需1 次加样，在同一条件下进行检测反应，实现同时检测PEDV和TGEV；(2)样品前处理完全统一， 操作简单，仅需100 μL的样品加样量即可完成检测；(3)检测时间短(5-8min)，结果判定标 准统一。 本发明提供的同时检测PEDV和TGEV的免疫胶体金速测卡可为实际检测部门提供 快速、现场和灵敏的检测手段，尤其适用于猪组织粪便样本的检测。 附图说明 图1是示意性示出本发明的速测卡结构的图。 图2是速测卡中试纸条组成的分解结构示意图。 图3是示出用本发明实施例的速测卡对空白样品PBS检测时结果的黑白图像。 图4是示出用本发明实施例的速测卡对含PEDV病毒粒子的溶液样本检测时结果的 黑白图像。 图5是示出用本发明实施例的速测卡对含TGEV病毒粒子的溶液样本检测时结果的 黑白图像。 图6是示出用本发明实施例的速测卡对同时含PEDV和TGEV病毒粒子的溶液检测时 6 CN 111596064 A 说　明　书 4/8 页 结果的黑白图像。 图7是示出用本发明实施例的速测卡对PEDV和TGEV双阴性粪便样本提取液检测时 结果的黑白图像。 图8是示出用本发明实施例的速测卡对PEDV单阳性粪便样本提取液检测时结果的 黑白图像。 图9是示出用本发明实施例的速测卡对TGEV单阳性粪便样本提取液检测时结果的 黑白图像。 图10是示出用本发明实施例的速测卡对PEDV和TGEV双阳性粪便样本提取液检测 时结果的黑白图像。