技术摘要：
本发明公开了一种具有广谱抗病毒功能的蛋白质CbAE的应用。蛋白质CbAE从N端至C端依次包括区段1‑区段12；区段1—区段12的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2自N端起第72至82位、第98至107位、第109至114位、第184至190位、第218至224位、第232至238位、第273至283位、第315至 全部
背景技术：
冠状病毒是一类有包膜的单股正链RNA病毒，因电镜下病毒颗粒形似皇冠而得名。 冠状病毒的宿主范围主要包括鸟类和哺乳类，迄今为止，已鉴定出七种可感染人类的冠状 病毒，其中SARS病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)的出现给世界经济卫生造成了极大威胁。新型冠状病毒属于冠状病毒科、冠 状病毒属病毒，感染人后可引起不同程度的症状，以发热、乏力、干咳为主要表现，严重者出 现肺炎、急性呼吸窘迫综合征甚至死亡。新型冠状病毒的主要传播方式是飞沫传播和接触 传播。目前，针对新型冠状病毒的尚无特效药及疫苗，对症支持性治疗是主要的治疗手段。 因此，针对新型冠状病毒的药物研究及新药研发迫在眉睫。 艾滋病毒(HIV)是一种有包膜的RNA病毒，属逆转录病毒，感染人类会引起免疫缺 陷综合征，目前尚无特效疫苗。登革病毒(DENV)和寨卡病毒(ZIKV)均属于黄病毒属病毒，主 要由蚊虫传播。登革病毒感染人类会引起出血热等症状，寨卡病毒感染人类后可引起头疼 发热、小头症等。单纯疱疹病毒(HSV)感染会造成口腔疱疹和生殖器疱疹。 目前针对病毒的治疗方法，主要通过抗病毒药物(如干扰素和核苷类药物)进行治 疗，干扰素治疗副作用较大，而核苷类药物较容易发生耐药性；对于没有合适治疗药物的病 毒性疾病，一般采用对症治疗。由于病毒较易发生突变，目前大多数病毒没有特效疫苗。鉴 于病毒性疾病为世界经济卫生带来的巨大威胁，开发出有广谱抗病毒功能的药物将对各种 病毒性疾病的治疗有重要意义。 色素细菌(Chromobacterium sp.)是一类蚊子肠道菌，可有效杀灭蚊虫。
技术实现要素：
本发明的目的是抑制病毒，如新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、新型冠状病毒假病毒、 登革病毒2型、人类免疫缺陷病毒假病毒、寨卡病毒、单纯疱疹病毒1型。 本发明首先保护蛋白质CbAE，可为如下a1)或a2)或a3)或a4)： a1)从N端至C端依次包括区段1-区段12； 区段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第72至82位所示； 区段2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第98至107位所示； 区段3的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第109至114位所示； 区段4的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第184至190位所示； 区段5的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第218至224位所示； 区段6的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第232至238位所示； 区段7的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第273至283位所示； 4 CN 111574633 A 说 明 书 2/18 页 区段8的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第315至319位所示； 区段9的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第339至344位所示； 区段10的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第389至393位所示； 区段11的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第419至423位所示； 区段12的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第425至429位所示； a2)在a1)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质； a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加得到的具有相同功能的蛋白质； a4)与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性且具有相同功能的蛋白 质。 具体的，所述蛋白质CbAE可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)或b7)： b1)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质； b2)氨基酸序列是SEQ ID NO：4所示的蛋白质； b3)氨基酸序列是SEQ ID NO：6所示的蛋白质； b4)氨基酸序列是SEQ ID NO：8所示的蛋白质； b5)在b1)或b2)或b3)或b4)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋 白质； b6)将b1)或b2)或b3)或b4)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质； b7)与b1)或b2)或b3)或b4)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性且具有相同 功能的蛋白质。 SEQ ID NO：2所示的蛋白质命名为蛋白质CbAE-1。SEQ ID NO：2由452个氨基酸残 基组成。 SEQ ID NO：6所示的蛋白质命名为蛋白质CbAE-2。SEQ ID NO：6由444个氨基酸残 基组成。 SEQ ID NO：4所示的蛋白质命名为融合蛋白CbAE-1。SEQ ID NO：4由501个氨基酸 残基组成。 SEQ ID NO：8所示的蛋白质命名为融合蛋白CbAE-2。SEQ ID NO：8由493个氨基酸 残基组成。 为了使蛋白质便于纯化和检测，可在由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋 白质CbAE-1或SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质CbAE-2的氨基末端或羧基末端 连接上如表1所示的标签。 表1.标签的序列 标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL 5 CN 111574633 A 说 明 书 3/18 页 上述蛋白质CbAE可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述蛋白质CbAE的编码基因可通过将SEQ ID NO：1所示的DNA序列或SEQ ID NO：5 所示的DNA序列在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。 编码所述蛋白质CbAE的核酸分子也属于本发明的保护范围。 具体的，编码所述蛋白质CbAE的核酸分子可为如下c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或 c6)或c7)或c8)： c1)编码区是SEQ ID NO：1所示的DNA分子； c2)编码区是SEQ ID NO：5所示的DNA分子； c3)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子； c4)核苷酸序列是SEQ ID NO：5所示的DNA分子； c5)核苷酸序列是SEQ ID NO：3所示的DNA分子； c6)核苷酸序列是SEQ ID NO：7所示的DNA分子； c7)与c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同 一性，且编码所述蛋白质CbAE的DNA分子； c8)在严格条件下与c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)限定的核苷酸序列杂交，且 编码所述蛋白质CbAE的DNA分子。 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。 其中，SEQ ID NO：1由1359个核苷酸组成，SEQ ID NO：1所示的核苷酸编码SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：3由1506个核苷酸组成，SEQ ID NO：3所示的核苷酸 编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：5由1335个核苷酸组成，SEQ IDNO：5所示 的核苷酸编码SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：7由1482个核苷酸组成，SEQ ID NO：7所示的核苷酸编码SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码所述蛋白质CbAE的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与 本发明分离得到的所述蛋白质CbAE的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码 所述蛋白质CbAE，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发 明的编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质CbAE-1或编码SEQ ID NO：6所示的 氨基酸序列组成的蛋白质CbAE-2的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或 更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件 进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以 用来评价相关序列之间的同一性。 编码所述蛋白质CbAE-1的核酸分子具体可为编码所述蛋白质CbAE-1的基因，命名 为CbAE-1基因。CbAE-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 编码所述融合蛋白CbAE-1的核酸分子具体可为编码所述融合蛋白CbAE-1的基因， 命名为CbAE-1融合基因。CbAE-1融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。 编码所述蛋白质CbAE-2的核酸分子具体可为编码所述蛋白质CbAE-2的基因，命名 为CbAE-2基因。CbAE-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。 6 CN 111574633 A 说 明 书 4/18 页 编码所述融合蛋白CbAE-2的核酸分子具体可为编码所述融合蛋白CbAE-2的基因， 命名为CbAE-2融合基因。CbAE-2融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。 含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也属于本发明的保 护范围。 含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为将所述蛋白质CbAE的编码基因插入 出发质粒，得到的重组质粒。所述出发质粒可为表达载体或克隆载体。 具体的，含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插 入所述蛋白质CbAE的编码基因，得到的重组质粒。 含有上述任一所述核酸分子的重组载体具体可为重组质粒pET-28a( )-CbAE-1或 重组质粒pET-28a( )-CbAE-2。 所述重组质粒pET-28a( )-CbAE-1可为将载体pET-28a( )的限制性内切酶EcoRI 和HindIII识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列为SEQ ID NO：1自5’末端起第1至 1356位所示的双链DNA分子，得到重组质粒。重组质粒pET-28a( )-CbAE-1中，SEQ ID NO：1 自5’末端起第1至1356位所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组 成)的编码序列融合，形成SEQ ID NO：3所示的融合基因CbAE-1，表达SEQ ID NO：4所示的具 有His-tag标签的融合蛋白CbAE-1。 所述重组质粒pET-28a( )-CbAE-2可为将载体pET-28a( )的限制性内切酶EcoRI 和HindIII识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列为SEQ ID NO：5自5’末端起第1至 1332位所示的双链DNA分子，得到重组质粒。重组质粒pET-28a( )-CbAE-2中，SEQ ID NO：5 自5’末端起第1至1332位所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组 成)的编码序列融合，形成SEQ ID NO：7所示的融合基因CbAE-2，表达SEQ ID NO：8所示的具 有His-tag标签的融合蛋白CbAE-2。 含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将上述任一所述重组载体导入出 发微生物得到的重组菌。 所述出发微生物可为大肠杆菌。 所述大肠杆菌可为大肠杆菌BL21(DE3)。 含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为BL21(DE3)－CbAE-1或BL21 (DE3)－CbAE-2。 所述BL21(DE3)－CbAE-1可为将重组质粒pET-28a( )-CbAE-1转化至大肠杆菌 BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。 所述BL21(DE3)－CbAE-2可为将重组质粒pET-28a( )-CbAE-2转化至大肠杆菌 BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。 本发明还保护上述任一所述蛋白质CbAE或上述任一所述核酸分子的应用，可为 d1)-d4)中的至少一种： d1)抑制病毒； d2)制备用于抑制病毒的产品； d3)抑制病毒假病毒； d4)制备用于抑制病毒假病毒的产品。 上述应用中，所述产品可为药物或病毒抑制剂。 7 CN 111574633 A 说 明 书 5/18 页 本发明还保护一种产品，其含有上述任一所述蛋白质CbAE或上述任一所述核酸分 子；所述产品的功能可为d1)-d4)中的至少一种： d1)抑制病毒； d2)制备用于抑制病毒的产品； d3)抑制病毒假病毒； d4)制备用于抑制病毒假病毒的产品。 所述产品可为药物或病毒抑制剂。 本发明还保护一种抑制病毒或病毒假病毒的方法，为采用上述任一所述蛋白质 CbAE处理病毒或病毒假病毒。 上述任一所述病毒可为冠状病毒、HIV、DENV、ZIKV和HSV中的至少一种。 上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理冠状病毒假病毒可为：将冠状病 毒假病毒溶液和蛋白质CbAE溶液混合，孵育，得到病毒-蛋白混合液。所述孵育可为35-39℃ (如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h 或1.5h)。用病毒-蛋白混合液感染细胞。感染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、 37℃或39℃)、5％CO2培养24-48h(如24-36h、36-48h、24h、36h或48h)。细胞可为HEK-293T细 胞。具体的，HEK-293T细胞可为稳定表达ACE2蛋白的HEK-293T细胞。结果表明，冠状病毒假 病毒感染率显著下降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制冠状病毒假病毒。 上述任一所述冠状病毒假病毒可为SARS-CoV-2假病毒。 所述SARS-CoV-2假病毒的构建方法可如下：以HIV-1病毒为骨架，将含有SARS- CoV-2刺突蛋白的编码基因的质粒和包含荧光素酶报告基因的pNL43Luci质粒共转染293T 细胞，得到SARS-CoV-2假病毒。构建方法参考如下文献：Characterization of anti-viral immunity in recovered individuals infected by SARS-CoV-2.MedRxiv，2020。 在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制SARS-CoV-2假病毒，IC50 为0.7344μg/mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制SARS-CoV-2假 病毒，IC50为1.041μg/mL。 上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理冠状病毒可为：将冠状病毒溶液 和蛋白质CbAE溶液混合，孵育，得到混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35 ℃、37℃或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。用混合液感染 细胞。感染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO2培养0.5- 1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。细胞可为Vero细胞。结果表明，冠状病毒 感染率显著下降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制冠状病毒。 上述任一所述冠状病毒可为SARS-CoV-2。 在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制SARS-CoV-2，IC50为 2.991μg/mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制SARS- CoV-2，IC50为2.490μg/mL。 上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理DENV可为：将DENV溶液和蛋白质 CbAE溶液混合，孵育，得到混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃ 或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。用混合液感染细胞。感 染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO2培养0.5-1 .5h(如 8 CN 111574633 A 说 明 书 6/18 页 0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。细胞可为Vero细胞。结果表明，DENV感染率显著下 降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制DENV。 上述任一所述DENV可为DENV-2。 在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制DENV-2，IC50为0.0022μ g/mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制DENV-2，IC50为3.898μg/ mL。 上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理ZIKV可为：将ZIKV溶液和蛋白质 CbAE溶液混合，孵育，得到混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃ 或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。用混合液感染细胞。感 染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO2培养0.5-1 .5h(如 0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。细胞可为Vero细胞。结果表明，ZIKV感染率显著下 降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制ZIKV。 在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制ZIKV，IC50为0.0035μg/ mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制ZIKV，IC50为1.080μg/mL。 上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理HIV假病毒可为：将HIV假病毒溶 液和蛋白质CbAE溶液混合，孵育，得到病毒-蛋白混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37 ℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。 用病毒-蛋白混合液感染细胞。感染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39 ℃)、5％CO2培养60-84h(如60-72h、72-84h、60h、72h或84h)。细胞可为GHOST细胞。结果表 明，HIV假病毒感染率显著下降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制HIV假病毒。 所述HIV假病毒的构建方法可如下：以HIV-1病毒为骨架，将含有HIV Env蛋白的编 码基因的质粒和包含荧光素酶报告基因的pNL43Luci质粒共转染293T细胞，得到HIV假病 毒；构建方法参考如下文献：Broadly resistant HIV-1 against CD4-binding site neutralizing antibodies.PLoS Pathogens，2019，15，e1007819。 在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制HIV假病毒，IC50为 0.0111μg/mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制HIV假病毒，IC50 为0.0863μg/mL。 上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理HSV可为：将HSV溶液和蛋白质 CbAE溶液混合，孵育，得到混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃ 或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。用混合液感染细胞。感 染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO2培养0.5-1 .5h(如 0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。细胞可为Vero细胞。结果表明，HSV感染率显著下 降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制HSV。 上述任一所述HSV可为HSV-1。 在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制HSV-1，IC50为1.027μg/ mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制HSV-1，IC50为0.4408μg/mL。 实验证明，融合蛋白CbAE-1和融合蛋白CbAE-2均可以显著抑制病毒假病毒和病毒 (如新型冠状病毒、新型冠状病毒假病毒、登革病毒2型、人类免疫缺陷病毒假病毒、寨卡病 毒、单纯疱疹病毒1型)。本发明具有重要的应用价值。 9 CN 111574633 A 说 明 书 7/18 页 附图说明 图1为融合蛋白CbAE-1溶液的SDS-PAGE。 图2为融合蛋白CbAE-2溶液的SDS-PAGE。 图3为不同浓度融合蛋白CbAE-1对新型冠状病毒假病毒的抑制作用。 图4为不同浓度融合蛋白CbAE-2对新型冠状病毒假病毒的抑制作用。 图5为不同浓度融合蛋白CbAE-1对新型冠状病毒的抑制作用。 图6为不同浓度融合蛋白CbAE-2对新型冠状病毒的抑制作用。 图7为不同浓度融合蛋白CbAE-1对登革病毒2型的抑制作用。 图8为不同浓度融合蛋白CbAE-2对登革病毒2型的抑制作用。 图9为不同浓度融合蛋白CbAE-1对寨卡病毒的抑制作用。 图10为不同浓度融合蛋白CbAE-2对寨卡病毒的抑制作用。 图11为不同浓度融合蛋白CbAE-1对人类免疫缺陷病毒假病毒的抑制作用。 图12为不同浓度融合蛋白CbAE-2对人类免疫缺陷病毒假病毒的抑制作用。 图13为不同浓度融合蛋白CbAE-1对单纯疱疹病毒1型的抑制作用。 图14为不同浓度融合蛋白CbAE-2对单纯疱疹病毒1型的抑制作用。
本发明公开了一种具有广谱抗病毒功能的蛋白质CbAE的应用。蛋白质CbAE从N端至C端依次包括区段1‑区段12；区段1—区段12的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2自N端起第72至82位、第98至107位、第109至114位、第184至190位、第218至224位、第232至238位、第273至283位、第315至 全部
背景技术：
冠状病毒是一类有包膜的单股正链RNA病毒，因电镜下病毒颗粒形似皇冠而得名。 冠状病毒的宿主范围主要包括鸟类和哺乳类，迄今为止，已鉴定出七种可感染人类的冠状 病毒，其中SARS病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)的出现给世界经济卫生造成了极大威胁。新型冠状病毒属于冠状病毒科、冠 状病毒属病毒，感染人后可引起不同程度的症状，以发热、乏力、干咳为主要表现，严重者出 现肺炎、急性呼吸窘迫综合征甚至死亡。新型冠状病毒的主要传播方式是飞沫传播和接触 传播。目前，针对新型冠状病毒的尚无特效药及疫苗，对症支持性治疗是主要的治疗手段。 因此，针对新型冠状病毒的药物研究及新药研发迫在眉睫。 艾滋病毒(HIV)是一种有包膜的RNA病毒，属逆转录病毒，感染人类会引起免疫缺 陷综合征，目前尚无特效疫苗。登革病毒(DENV)和寨卡病毒(ZIKV)均属于黄病毒属病毒，主 要由蚊虫传播。登革病毒感染人类会引起出血热等症状，寨卡病毒感染人类后可引起头疼 发热、小头症等。单纯疱疹病毒(HSV)感染会造成口腔疱疹和生殖器疱疹。 目前针对病毒的治疗方法，主要通过抗病毒药物(如干扰素和核苷类药物)进行治 疗，干扰素治疗副作用较大，而核苷类药物较容易发生耐药性；对于没有合适治疗药物的病 毒性疾病，一般采用对症治疗。由于病毒较易发生突变，目前大多数病毒没有特效疫苗。鉴 于病毒性疾病为世界经济卫生带来的巨大威胁，开发出有广谱抗病毒功能的药物将对各种 病毒性疾病的治疗有重要意义。 色素细菌(Chromobacterium sp.)是一类蚊子肠道菌，可有效杀灭蚊虫。
技术实现要素：
本发明的目的是抑制病毒，如新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、新型冠状病毒假病毒、 登革病毒2型、人类免疫缺陷病毒假病毒、寨卡病毒、单纯疱疹病毒1型。 本发明首先保护蛋白质CbAE，可为如下a1)或a2)或a3)或a4)： a1)从N端至C端依次包括区段1-区段12； 区段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第72至82位所示； 区段2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第98至107位所示； 区段3的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第109至114位所示； 区段4的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第184至190位所示； 区段5的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第218至224位所示； 区段6的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第232至238位所示； 区段7的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第273至283位所示； 4 CN 111574633 A 说 明 书 2/18 页 区段8的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第315至319位所示； 区段9的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第339至344位所示； 区段10的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第389至393位所示； 区段11的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第419至423位所示； 区段12的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第425至429位所示； a2)在a1)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质； a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加得到的具有相同功能的蛋白质； a4)与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性且具有相同功能的蛋白 质。 具体的，所述蛋白质CbAE可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)或b7)： b1)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质； b2)氨基酸序列是SEQ ID NO：4所示的蛋白质； b3)氨基酸序列是SEQ ID NO：6所示的蛋白质； b4)氨基酸序列是SEQ ID NO：8所示的蛋白质； b5)在b1)或b2)或b3)或b4)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋 白质； b6)将b1)或b2)或b3)或b4)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质； b7)与b1)或b2)或b3)或b4)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性且具有相同 功能的蛋白质。 SEQ ID NO：2所示的蛋白质命名为蛋白质CbAE-1。SEQ ID NO：2由452个氨基酸残 基组成。 SEQ ID NO：6所示的蛋白质命名为蛋白质CbAE-2。SEQ ID NO：6由444个氨基酸残 基组成。 SEQ ID NO：4所示的蛋白质命名为融合蛋白CbAE-1。SEQ ID NO：4由501个氨基酸 残基组成。 SEQ ID NO：8所示的蛋白质命名为融合蛋白CbAE-2。SEQ ID NO：8由493个氨基酸 残基组成。 为了使蛋白质便于纯化和检测，可在由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋 白质CbAE-1或SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质CbAE-2的氨基末端或羧基末端 连接上如表1所示的标签。 表1.标签的序列 标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL 5 CN 111574633 A 说 明 书 3/18 页 上述蛋白质CbAE可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述蛋白质CbAE的编码基因可通过将SEQ ID NO：1所示的DNA序列或SEQ ID NO：5 所示的DNA序列在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。 编码所述蛋白质CbAE的核酸分子也属于本发明的保护范围。 具体的，编码所述蛋白质CbAE的核酸分子可为如下c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或 c6)或c7)或c8)： c1)编码区是SEQ ID NO：1所示的DNA分子； c2)编码区是SEQ ID NO：5所示的DNA分子； c3)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子； c4)核苷酸序列是SEQ ID NO：5所示的DNA分子； c5)核苷酸序列是SEQ ID NO：3所示的DNA分子； c6)核苷酸序列是SEQ ID NO：7所示的DNA分子； c7)与c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同 一性，且编码所述蛋白质CbAE的DNA分子； c8)在严格条件下与c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)限定的核苷酸序列杂交，且 编码所述蛋白质CbAE的DNA分子。 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。 其中，SEQ ID NO：1由1359个核苷酸组成，SEQ ID NO：1所示的核苷酸编码SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：3由1506个核苷酸组成，SEQ ID NO：3所示的核苷酸 编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：5由1335个核苷酸组成，SEQ IDNO：5所示 的核苷酸编码SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：7由1482个核苷酸组成，SEQ ID NO：7所示的核苷酸编码SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码所述蛋白质CbAE的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与 本发明分离得到的所述蛋白质CbAE的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码 所述蛋白质CbAE，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发 明的编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质CbAE-1或编码SEQ ID NO：6所示的 氨基酸序列组成的蛋白质CbAE-2的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或 更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件 进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以 用来评价相关序列之间的同一性。 编码所述蛋白质CbAE-1的核酸分子具体可为编码所述蛋白质CbAE-1的基因，命名 为CbAE-1基因。CbAE-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 编码所述融合蛋白CbAE-1的核酸分子具体可为编码所述融合蛋白CbAE-1的基因， 命名为CbAE-1融合基因。CbAE-1融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。 编码所述蛋白质CbAE-2的核酸分子具体可为编码所述蛋白质CbAE-2的基因，命名 为CbAE-2基因。CbAE-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。 6 CN 111574633 A 说 明 书 4/18 页 编码所述融合蛋白CbAE-2的核酸分子具体可为编码所述融合蛋白CbAE-2的基因， 命名为CbAE-2融合基因。CbAE-2融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。 含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也属于本发明的保 护范围。 含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为将所述蛋白质CbAE的编码基因插入 出发质粒，得到的重组质粒。所述出发质粒可为表达载体或克隆载体。 具体的，含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插 入所述蛋白质CbAE的编码基因，得到的重组质粒。 含有上述任一所述核酸分子的重组载体具体可为重组质粒pET-28a( )-CbAE-1或 重组质粒pET-28a( )-CbAE-2。 所述重组质粒pET-28a( )-CbAE-1可为将载体pET-28a( )的限制性内切酶EcoRI 和HindIII识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列为SEQ ID NO：1自5’末端起第1至 1356位所示的双链DNA分子，得到重组质粒。重组质粒pET-28a( )-CbAE-1中，SEQ ID NO：1 自5’末端起第1至1356位所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组 成)的编码序列融合，形成SEQ ID NO：3所示的融合基因CbAE-1，表达SEQ ID NO：4所示的具 有His-tag标签的融合蛋白CbAE-1。 所述重组质粒pET-28a( )-CbAE-2可为将载体pET-28a( )的限制性内切酶EcoRI 和HindIII识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列为SEQ ID NO：5自5’末端起第1至 1332位所示的双链DNA分子，得到重组质粒。重组质粒pET-28a( )-CbAE-2中，SEQ ID NO：5 自5’末端起第1至1332位所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组 成)的编码序列融合，形成SEQ ID NO：7所示的融合基因CbAE-2，表达SEQ ID NO：8所示的具 有His-tag标签的融合蛋白CbAE-2。 含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将上述任一所述重组载体导入出 发微生物得到的重组菌。 所述出发微生物可为大肠杆菌。 所述大肠杆菌可为大肠杆菌BL21(DE3)。 含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为BL21(DE3)－CbAE-1或BL21 (DE3)－CbAE-2。 所述BL21(DE3)－CbAE-1可为将重组质粒pET-28a( )-CbAE-1转化至大肠杆菌 BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。 所述BL21(DE3)－CbAE-2可为将重组质粒pET-28a( )-CbAE-2转化至大肠杆菌 BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。 本发明还保护上述任一所述蛋白质CbAE或上述任一所述核酸分子的应用，可为 d1)-d4)中的至少一种： d1)抑制病毒； d2)制备用于抑制病毒的产品； d3)抑制病毒假病毒； d4)制备用于抑制病毒假病毒的产品。 上述应用中，所述产品可为药物或病毒抑制剂。 7 CN 111574633 A 说 明 书 5/18 页 本发明还保护一种产品，其含有上述任一所述蛋白质CbAE或上述任一所述核酸分 子；所述产品的功能可为d1)-d4)中的至少一种： d1)抑制病毒； d2)制备用于抑制病毒的产品； d3)抑制病毒假病毒； d4)制备用于抑制病毒假病毒的产品。 所述产品可为药物或病毒抑制剂。 本发明还保护一种抑制病毒或病毒假病毒的方法，为采用上述任一所述蛋白质 CbAE处理病毒或病毒假病毒。 上述任一所述病毒可为冠状病毒、HIV、DENV、ZIKV和HSV中的至少一种。 上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理冠状病毒假病毒可为：将冠状病 毒假病毒溶液和蛋白质CbAE溶液混合，孵育，得到病毒-蛋白混合液。所述孵育可为35-39℃ (如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h 或1.5h)。用病毒-蛋白混合液感染细胞。感染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、 37℃或39℃)、5％CO2培养24-48h(如24-36h、36-48h、24h、36h或48h)。细胞可为HEK-293T细 胞。具体的，HEK-293T细胞可为稳定表达ACE2蛋白的HEK-293T细胞。结果表明，冠状病毒假 病毒感染率显著下降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制冠状病毒假病毒。 上述任一所述冠状病毒假病毒可为SARS-CoV-2假病毒。 所述SARS-CoV-2假病毒的构建方法可如下：以HIV-1病毒为骨架，将含有SARS- CoV-2刺突蛋白的编码基因的质粒和包含荧光素酶报告基因的pNL43Luci质粒共转染293T 细胞，得到SARS-CoV-2假病毒。构建方法参考如下文献：Characterization of anti-viral immunity in recovered individuals infected by SARS-CoV-2.MedRxiv，2020。 在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制SARS-CoV-2假病毒，IC50 为0.7344μg/mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制SARS-CoV-2假 病毒，IC50为1.041μg/mL。 上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理冠状病毒可为：将冠状病毒溶液 和蛋白质CbAE溶液混合，孵育，得到混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35 ℃、37℃或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。用混合液感染 细胞。感染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO2培养0.5- 1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。细胞可为Vero细胞。结果表明，冠状病毒 感染率显著下降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制冠状病毒。 上述任一所述冠状病毒可为SARS-CoV-2。 在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制SARS-CoV-2，IC50为 2.991μg/mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制SARS- CoV-2，IC50为2.490μg/mL。 上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理DENV可为：将DENV溶液和蛋白质 CbAE溶液混合，孵育，得到混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃ 或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。用混合液感染细胞。感 染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO2培养0.5-1 .5h(如 8 CN 111574633 A 说 明 书 6/18 页 0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。细胞可为Vero细胞。结果表明，DENV感染率显著下 降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制DENV。 上述任一所述DENV可为DENV-2。 在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制DENV-2，IC50为0.0022μ g/mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制DENV-2，IC50为3.898μg/ mL。 上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理ZIKV可为：将ZIKV溶液和蛋白质 CbAE溶液混合，孵育，得到混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃ 或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。用混合液感染细胞。感 染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO2培养0.5-1 .5h(如 0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。细胞可为Vero细胞。结果表明，ZIKV感染率显著下 降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制ZIKV。 在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制ZIKV，IC50为0.0035μg/ mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制ZIKV，IC50为1.080μg/mL。 上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理HIV假病毒可为：将HIV假病毒溶 液和蛋白质CbAE溶液混合，孵育，得到病毒-蛋白混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37 ℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。 用病毒-蛋白混合液感染细胞。感染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39 ℃)、5％CO2培养60-84h(如60-72h、72-84h、60h、72h或84h)。细胞可为GHOST细胞。结果表 明，HIV假病毒感染率显著下降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制HIV假病毒。 所述HIV假病毒的构建方法可如下：以HIV-1病毒为骨架，将含有HIV Env蛋白的编 码基因的质粒和包含荧光素酶报告基因的pNL43Luci质粒共转染293T细胞，得到HIV假病 毒；构建方法参考如下文献：Broadly resistant HIV-1 against CD4-binding site neutralizing antibodies.PLoS Pathogens，2019，15，e1007819。 在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制HIV假病毒，IC50为 0.0111μg/mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制HIV假病毒，IC50 为0.0863μg/mL。 上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理HSV可为：将HSV溶液和蛋白质 CbAE溶液混合，孵育，得到混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃ 或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。用混合液感染细胞。感 染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO2培养0.5-1 .5h(如 0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。细胞可为Vero细胞。结果表明，HSV感染率显著下 降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制HSV。 上述任一所述HSV可为HSV-1。 在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制HSV-1，IC50为1.027μg/ mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制HSV-1，IC50为0.4408μg/mL。 实验证明，融合蛋白CbAE-1和融合蛋白CbAE-2均可以显著抑制病毒假病毒和病毒 (如新型冠状病毒、新型冠状病毒假病毒、登革病毒2型、人类免疫缺陷病毒假病毒、寨卡病 毒、单纯疱疹病毒1型)。本发明具有重要的应用价值。 9 CN 111574633 A 说 明 书 7/18 页 附图说明 图1为融合蛋白CbAE-1溶液的SDS-PAGE。 图2为融合蛋白CbAE-2溶液的SDS-PAGE。 图3为不同浓度融合蛋白CbAE-1对新型冠状病毒假病毒的抑制作用。 图4为不同浓度融合蛋白CbAE-2对新型冠状病毒假病毒的抑制作用。 图5为不同浓度融合蛋白CbAE-1对新型冠状病毒的抑制作用。 图6为不同浓度融合蛋白CbAE-2对新型冠状病毒的抑制作用。 图7为不同浓度融合蛋白CbAE-1对登革病毒2型的抑制作用。 图8为不同浓度融合蛋白CbAE-2对登革病毒2型的抑制作用。 图9为不同浓度融合蛋白CbAE-1对寨卡病毒的抑制作用。 图10为不同浓度融合蛋白CbAE-2对寨卡病毒的抑制作用。 图11为不同浓度融合蛋白CbAE-1对人类免疫缺陷病毒假病毒的抑制作用。 图12为不同浓度融合蛋白CbAE-2对人类免疫缺陷病毒假病毒的抑制作用。 图13为不同浓度融合蛋白CbAE-1对单纯疱疹病毒1型的抑制作用。 图14为不同浓度融合蛋白CbAE-2对单纯疱疹病毒1型的抑制作用。
