技术摘要：
本发明涉及斑马鱼模型技术领域，具体涉及一种prep基因缺失型斑马鱼的构建方法。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的prep基因上设计打靶位点，在体外合成的特异性gRNA和Cas9‑蛋白，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养48h后，通过选取胚胎进行基因型分析，从 全部
背景技术：
脯氨酰内肽酶Prolyl endopeptidase(prep)是一种能特异性水解多肽链中脯氨 酸残基羧基端肽键的非常保守的丝氨酸肽酶，在rat和mice脑部早期发育过程中，prep基因 发挥着非常重要的作用，在脑部的各个部位包括大脑皮层，海马区，下丘脑，小脑和骨髓神 经上皮等都有高表达，以及通过促进小脑神经元细胞的增殖和分化调控小脑的发育。除此 之外prep也在一些与脑部神经系统相关的疾病样品中被检测到。这些研究表明prep对于机 体脑部的发育与疾病密切相关。也有报道表明小鼠下丘脑的脯氨酰内肽酶调控胰腺中的胰 岛素和胰高血糖素的分泌，prep还具有另外一个同源蛋白脯氨酰羧肽酶prolyl carboxypeptidase(PRCP)，它们发挥着同样的功能，在人类胰腺癌细胞中，prep与prcp调控 胰岛素受体IRS-1激活PI3K/AKT/mTOR信号通路从而促进细胞的增殖和生存，这暗示prep可 以通过IRS-1-PI3K信号轴调控糖类代谢，细胞增殖和细胞生存。除此之外，在胚胎早期发育 过程中，prep在很多组织器官(例如肺，心脏，肾脏和肝脏)中都有被检测出高表达，也参与 哺乳动物生殖功能的调控。prep在组织器官发育过程中发挥着非常重要的功能，但是其调 控的具体分子机制知之甚少，以及prep在器官再生尤其肝脏再生过程中基本没有报道。 基于此，提供一种prep基因缺失型斑马鱼的构建方法，提高对prep基因的研究显 得尤为重要。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种prep基因缺失型斑马鱼的构建方法，本发明中，prep基 因在脑部的各个部位包括大脑皮层，海马区，下丘脑，小脑和骨髓神经上皮等都有高表达， prep与机体脑部的发育与疾病密切相关，以及prep在器官再生，尤其肝脏再生过程中起作 用。 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种prep基因缺失型斑马鱼的构建方法，包括如下步骤： S1、查询斑马鱼prep基因的基因组DNA序列，并分析其功能结构域，根据CRISPR/ C a s 9敲除原理 ，在p r e p基因第3外显子找到p r e p基因的靶位点 ，序列为5’- GGTCTCGCACTGCTCCAGGAAGG-3’，并设计靶位点长引物，靶位点长引物序列为5’- Taatacgactcactatag GGTCTCGCACTGCTCCA GGAAGG gttttagagctagaaatagc-3’，gRNA接头 引物序列为5’-AGCACCG ACTCGGTGCCACTT-3’。 S2、primer star PCR获得gRNA的体外转录模板； S3、根据S2获得的gRNA的体外转录模板进行体外转录，并提取纯化，获得纯化的 gRNA； 3 CN 111575320 A 说 明 书 2/5 页 S4、将纯化的gRNA和Cas9蛋白显微注射至斑马鱼一细胞期的受精卵，培养获得稳 定遗传prep纯合突变斑马鱼品系，即prep基因缺失型斑马鱼。 进一步的，S2中，反应体系总体积50ul，体系如下： gRNA cDNA1ul，靶位点长引物1ul，gRNA接头引物1ul，dNTP Mix 4ul，5×Primer star buffer 10ul，Primer star酶1ul，ddH2O 32ul。 进一步的，S2中，反应程序为： 98℃2min；重复35个循环以下步骤：98℃15s，58℃15s，72℃20s；72℃5min；72℃ 30min。 进一步的，S3中，反应体系为：模板DNA10ul，10×RNA polymerase Reaction buffer2ul，25mM rNTP Mix0.8ul，RNase Inhibitor0.5ul，T7 RNA polymerase2ul，RNase free H2O4.7 ul； 更进一步的，S3中，反应程序为： 37℃条件下合成3小时。 进一步的，S4的培养具体包括以下步骤： S1、将显微注射的受精卵培养孵化，Sanger测序检测靶位点的有效性，筛选出有基 因突变的，记作F0代，饲养至成鱼； S2、将F0代成鱼与WT侧交得到F1代； S3、利用基因型鉴定的方法确定prep基因敲除的F1代； S4、从F1代突变体中挑选相同突变类型的F1代进行交配得到F2代； S5、基因型鉴定F2代中prep基因敲除的纯合子即为能稳定遗传prep纯合突变斑马 鱼品系，即prep基因缺失型斑马鱼。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： (1)本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成 本低，且可同时对靶基因上多个位点进行切，沉默任意数目的单个基因，且敲除prep基因斑 马鱼胚胎出现未发现的肝脏再生缺陷。 (2)本发明成功构建的prep基因缺失型斑马鱼可作为研究研究肝脏再生缺陷的模 型，并应用于筛选治疗肝脏再生缺陷的药物。 附图说明 图1为实施例1测序峰图，A为野生型，B为Prep杂合子，C为Prep突变体。 图2为实施例1的与PCR产物与标准目的序列的比对结果。 图3为实施例1构建成功的prep基因缺失型斑马鱼与野生型斑马鱼的测序结果比 较。 图4为共聚焦显微镜下实施例1构建成功的prep基因缺失型斑马鱼与野生型斑马 鱼肝脏再生情况比较。 图5为实施例1构建成功的prep基因缺失型斑马鱼与野生型斑马鱼不同时期Foxa3 基因和hnf4a基因表达情况。 4 CN 111575320 A 说 明 书 3/5 页
