技术摘要：
本发明涉及一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，包括gDNA清除剂缓冲液、gDNA清除剂、cDNA逆转录缓冲液、cDNA逆转录酶混合物、逆转录引物混合物、实时荧光定量聚合酶链式反应液、探针、阳性对照标准品和无酶水。探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的  全部
背景技术：
目前，中国不孕症的发生率约在15-20％，而且不孕不育患者的数量每年以数十万 的速度递增。婚育年龄的推迟、工作压力的堆积以及生活方式的改变等因素直接或间接地 减低了人们的生育能力。随着世界上首例试管婴儿的降生，体外受精-胚胎移植(IVF-ET)已 成为不孕女性尽快获得妊娠的有效途径。但在实际临床实践过程中，低胚胎种植率仍然是 长期困扰辅助生殖技术医护人员的难题之一。子宫内膜容受性作为胚胎植入过程中的关键 因素，其改变是低胚胎种植率的重要原因之一。 子宫内膜容受性是指子宫内膜对于胚胎的接受能力，指子宫内膜处于一种允许胚 胎定位、黏附和侵入的状态。这段子宫内膜接受胚胎的时间，也被称为种植窗期，一般出现 在排卵或者hCG扳机后的第7-9天。目前研究表明，子宫内膜的容受性受到时间和病理因素 的双重调节。早于或者晚于这段时间，子宫内膜的着床期尚未开放或已经闭合，均不利于胚 胎的种植。同时，病理性的因素，包括内膜基质细胞、免疫细胞、细胞因子的异常，都会影响 子宫内膜的容受性，从而导致流产或不孕等不良妊娠结局的发生。 传统临床上对于子宫内膜容受性的诊断，主要是参考形态学的评估。其评估指标 主要包括三大类：(1)子宫内膜厚度、回声和血流等超声形态；(2)腺体大小、间质疏密和血 管丰度等组织活检形态；(3)子宫内膜胞饮突。然而，形态学评估无法准确反映子宫内膜细 胞和细胞因素的表达情况，因此其评估的有效性在临床实践中受到一定的争议。 鉴于形态学评估的局限性，目前基础科研和临床实践中，已逐渐采用基于免疫组 织化学染色技术和基因转录组分析技术的方法进行子宫内膜容受性评估。相较于免疫组织 化学染色技术的分析，采用基因转录组分析技术所需要的患者组织样本较少，因此能够减 少患者因组织样本取样时痛苦。同时，基于转录组分析技术的方法能够检测多种生物分子 标记物，确保子宫内膜容受性评估的准确性。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种评估子宫内膜容受性的试剂盒及其使用 方法。 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种评估子宫内膜容受性的试剂盒， 包括gDNA清除剂缓冲液、gDNA清除剂、cDNA逆转录缓冲液、cDNA逆转录酶混合物、逆转录引 物混合物、实时荧光定量聚合酶链式反应液、探针、阳性对照标准品和无酶水。 本发明的有益效果是：探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩 翰的基因组中把目的基因显示出来，针对逆转录产物的特定序列所结合探针信号的检测从 而检测特定基因的表达量，从而能够推测子宫内膜容受性，采用该种方式操作简单、灵敏性 5 CN 111575368 A 说　明　书 2/11 页 高、特异性强，且检测结果准确、客观、快捷。从而帮助临床医生明确子宫内膜容受性的状 态，以期为不孕患者早期诊断、靶向干预以及指导胚胎移植时机提供依据。 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进： 进一步，所述gDNA清除剂缓冲液为TaKaRa  PrimeScriptTM5×gDNAEraser  Buffer， 所述gDNA清除剂为TaKaRa  PrimeScriptTMgDNA  Eraser；所述cDNA逆转录酶混合物为TaKaRa  PrimeScriptTMRT  Enzyme  Mix  I；所述逆转录引物混合物为TaKaRa  PrimeScriptTMRT  Primer  Mix；所述实时荧光定量聚合酶链式反应液为TaqManTMUniversal  Master  Mix  II, with  UNG。 采用上述进一步方案的有益效果是上述试剂能够辅助实现基因组DNA的清除、逆 转录以及实时荧光定量聚合酶链式反应。 进一步，所述探针包括7种，所述探针包括相关基因探针和内参基因探针，所述相 关基因探针包括SLC2A1基因探针、HK2基因探针、PKM2基因探针、HIF1A基因探针、SLC16A3基 因探针，所述内参基因探针包括ACTB基因探针和B2M基因探针；所述阳性对照标准品为含有 SLC2A1基因的质粒、含有HK2基因的质粒、含有PKM2基因的质粒、含有HIF1A基因的质粒、含 有SLC16A3基因的质粒、含有ACTB基因的质粒以及含有B2M基因的质粒的混合质粒，所述无 酶水包括第一无酶水和第二无酶水。 采用上述进一步方案的有益效果是本发明通过检测糖酵解通路相关基因的表达 水平，能够简单、高效地评估子宫内膜容受性，易于制造和使用，市场需求量大，适合规模化 生产。 进一步，还包括单独质粒，所述单独质粒包括7种，分别为含有SLC2A1基因的质粒、 含有HK2基因的质粒、含有PKM2基因的质粒、含有HIF1A基因的质粒、含有SLC16A3基因的质 粒、含有ACTB基因的质粒以及含有B2M基因的质粒。 采用上述进一步方案的有益效果是本发明通过检测含有相关基因和内参基因的 质粒的反应荧光量和含量的值来做标准曲线，以便得到基因的表达量。对检测结果进行进 一步验证。 进一步，所述试剂盒包括盒体以及设置于所述盒体内的第一抽屉式隔层、第二抽 屉式隔层和第三抽屉式隔层， 所述第一抽屉式隔层内设有第一泡沫垫，所述第二抽屉式隔层内设有第二泡沫 垫， 所述第一泡沫垫开设6个分别放有gDNA清除剂缓冲液、gDNA清除剂、cDNA逆转录缓 冲液、cDNA逆转录酶混合物、逆转录引物混合物和第一无酶水的凹槽，所述第一泡沫垫开设 一个放置逆转录反应使用96孔板的腔体， 所述第二泡沫垫上开设7个放置探针的凹槽、1个放置阳性标准品的凹槽、放置实 时荧光定量聚合酶链式反应液的凹槽和放置第二无酶水的凹槽，所述第二泡沫垫开设放置 定量聚合酶链式反应使用的96孔板的腔体， 所述第三隔层内放置第一冰盒和第二冰盒，所述第一冰盒用来放置96孔板，所述 第二冰盒用来放置离心管。 采用上述进一步方案的有益效果是(1)实验稳定性好：逆转录试剂和实时荧光定 量聚合酶链式反应的反应试剂平常保存在-20℃的环境下，呈现冰冻的状态。使用时需要缓 6 CN 111575368 A 说　明　书 3/11 页 慢解冻以减少试剂因为温度骤变而失效，本试剂盒提供的放置离心管的冰盒，能够让上述 试剂均匀恢复到液体状态。本试剂盒提供的放置96孔板冰盒，则可以让反应混合液在进行 反应前，保持较低的温度，减少非特异性反应。(2)试剂盒分区明确：用到哪层试剂就取出哪 个隔层，避免了提前解冻试剂。同时，也减少了检测人员拿错试剂的可能性。 进一步，所述第二泡沫垫上还开设7个放置单独质粒的凹槽，7个放置所述单独质 粒的凹槽分别放置含有SLC2A1基因的质粒、含有HK2基因的质粒、含有PKM2基因的质粒、含 有HIF1A基因的质粒、含有SLC16A3基因的质粒、含有ACTB基因的质粒和含有B2M基因的质 粒；7个放置所述探针的凹槽分别放置SLC2A1基因探针、HK2基因探针、PKM2基因探针、HIF1A 基因探针、SLC16A3基因探针、ACTB基因探针和B2M基因探针。 采用上述进一步方案的有益效果是本发明通过检测糖酵解通路相关基因的表达 水平，能够简单、高效地评估子宫内膜容受性，易于制造和使用，市场需求量大，适合规模化 生产；通过检测含有相关基因和内参基因的质粒的反应荧光量和含量的值来做标准曲线， 以便得到样本基因的表达量。 进一步，所述第一抽屉式隔层、所述第二抽屉式隔层和所述第三抽屉式隔层从上 至下层叠设置且其后端均设置第一磁性锁扣，所述盒体分别对应所述第一磁性锁扣设置第 二磁性锁扣，所述第一磁性锁扣和所述第二磁性锁扣通过磁性连接；所述第一抽屉式隔层、 所述第二抽屉式隔层和所述第三抽屉式隔层前端均设置把手；所述试剂盒还包括一份使用 说明书。 采用上述进一步方案的有益效果是密封性好：本发明的试剂盒，在盒体和抽屉式 隔层相应的设置了磁性锁合装置，试剂盒密封性好，便于移动和运输。 本发明还涉及一种所述评估子宫内膜容受性的试剂盒的使用方法，包括如下步 骤：步骤1，RNA提取：获取子宫内膜组织样本，之后提取所述子宫内膜组织样本的RNA；步骤 2，清除gDNA：在所述步骤1得到的RNA中加入gDNA清除剂缓冲液、gDNA清除剂和无酶水混合 后放入PCR仪中进行反应,之后冷却得到第一混合物；步骤3,逆转录反应：在所述第一混合 物中加入cDNA逆转录缓冲液、cDNA逆转录酶混合物和逆转录引物混合物混合后放入PCR仪 中进行逆转录反应，得到cDNA；步骤4，获取模板：将所述cDNA稀释得到检测样品的模板，将 能够同时检测7种待测基因的阳性对照标准品稀释得到阳性对照标准品的上样模板；步骤 5，实时荧光定量聚合酶链式反应：将所述步骤4中所述检测样品的模板、实时荧光定量聚合 酶链式反应反应液和探针混合后放入实时荧光定量PCR仪器中进行实时荧光定量聚合酶链 式反应；将所述步骤4中所述阳性对照标准品的上样模板、实时荧光定量聚合酶链式反应反 应液和探针混合后放入实时荧光定量PCR仪器中进行实时荧光定量聚合酶链式反应；根据 实验结果得到检测基因表达量；步骤6，判断容受性：将所述步骤5得到的基因表达量与阳性 对照标准品的上样模板值进行比较，得到待测样品相较于阳性对照标准品的变化比例，从 而判断子宫内膜的容受性。 采用上述进一步方案的有益效果是上述方法能够实现检测相关基因的表达水平， 能够简单、高效地评估子宫内膜容受性，易于制造和使用，市场需求量大，适合规模化生产。 进一步，所述步骤1中，提取所述子宫内膜组织样本的RNA的方法为Qiagen  RNeasy  Plus  Mini  Kit或者ThermoFisher  Dynabeads  mRNA  DIRECTPurification  Kit；所述步骤2 中，PCR仪设置为42℃反应2min；所述步骤3中，PCR仪设置为37℃反应15min，85℃反应5sec； 7 CN 111575368 A 说　明　书 4/11 页 所述步骤4中，稀释倍数为10；所述步骤5中所述探针包括相关基因探针和内参基因探针，所 述相关基因探针包括SLC2A1基因探针、HK2基因探针、PKM2基因探针、HIF1A基因探针和 SLC16A3基因探针，所述内参基因探针包括ACTB基因探针和B2M基因探针；所述步骤5中基因 表达量包括相关基因表达量和内参基因表达量；所述步骤6中通过相关基因表达量与预定 值进行比较，从而判断子宫内膜的容受性；所述评估子宫内膜容受性的试剂盒的使用方法 还包括通过内参基因表达量对样本上样量进行校正的步骤。 采用上述进一步方案的有益效果是上述PCR参数的设置能够分别实现去除基因组 DNA和逆转录反应。与“阳性标准对照品”进行比较，得到样本相关基因和内参基因的相对表 达量。通过内参基因的表达量能够校正基因的表达量，从而得到准确的效果，使得检测更为 精准。 进一步，还包括验证步骤，所述验证步骤包括，步骤a，RNA提取：获取子宫内膜组织 样本，之后提取所述子宫内膜组织样本的RNA；步骤b，清除gDNA：在所述步骤a得到的RNA中 加入gDNA清除剂缓冲液、gDNA清除剂和无酶水混合后放入PCR仪中进行反应,之后冷却得到 第一混合物；步骤c,逆转录反应：在所述第一混合物中加入cDNA逆转录缓冲液、cDNA逆转录 酶混合物和逆转录引物混合物混合后放入PCR仪中进行逆转录反应，得到cDNA；步骤d，获取 模板：将所述cDNA稀释得到检测样品的模板，将含有检测基因的每种质粒分别稀释不同倍 数作为标曲模板检测荧光量制作标准曲线；步骤e，实时荧光定量聚合酶链式反应：将所述 步骤d中所述检测样品的模板、实时荧光定量聚合酶链式反应反应液和探针混合后放入实 时荧光定量PCR仪器中进行实时荧光定量聚合酶链式反应；将所述步骤d中所述标曲模板、 实时荧光定量聚合酶链式反应反应液和探针混合后放入实时荧光定量PCR仪器中进行实时 荧光定量聚合酶链式反应；根据实验结果得到检测基因表达量；步骤f，判断容受性：将所述 步骤e得到的基因表达量与预定值进行比较，从而判断子宫内膜的容受性。 采用上述进一步方案的有益效果是本发明通过检测糖酵解通路相关基因的表达 水平，能够简单、高效地评估子宫内膜容受性，易于制造和使用，市场需求量大，适合规模化 生产。通过检测含有相关基因和内参基因的质粒的反应荧光量和含量的值来做标准曲线， 以便得到样本相关基因和内参基因的表达量。通过内参基因的表达量能够校正相关基因的 表达量，从而得到准确的结果，使得检测更为精准。 进一步，所述步骤a中，提取所述子宫内膜组织样本的RNA的方法为Qiagen  RNeasy  Plus  Mini  Kit或者ThermoFisher  Dynabeads  mRNA  DIRECT  Purification  Kit；所述步骤 b中，PCR仪设置为42℃反应2min；所述步骤c中，PCR仪设置为37℃反应15min，85℃反应 5sec；所述步骤d中，稀释倍数为10；所述步骤e中所述探针包括相关基因探针和内参基因探 针，所述相关基因探针包括SLC2A1基因探针、HK2基因探针、PKM2基因探针、HIF1A基因探针 和SLC16A3基因探针，所述内参基因探针包括ACTB基因探针和B2M基因探针；所述含有检测 基因的质粒包括含有SLC2A1基因的质粒、含有HK2基因的质粒、含有PKM2基因的质粒、含有 HIF1A基因的质粒、含有SLC16A3基因的质粒、含有ACTB基因的质粒和含有B2M基因的质粒； 所述步骤d中将含有检测基因的每种质粒分别稀释100倍，1000倍，10000倍，100000倍， 1000000倍作为标曲模板检测荧光量制作标准曲线；所述步骤e中基因表达量包括相关基因 表达量和内参基因表达量；所述步骤f中通过相关基因表达量与预定值进行比较，从而判断 子宫内膜的容受性；所述评估子宫内膜容受性的试剂盒的使用方法还包括通过内参基因表 8 CN 111575368 A 说　明　书 5/11 页 达量对样本上样量进行校正的步骤。 采用上述进一步方案的有益效果是本发明通过检测含有相关基因和内参基因的 质粒的反应荧光量和含量的值来做标准曲线，以便得到样本相关基因和内参基因的表达 量。通过内参基因的表达量能够校正相关基因的表达量，从而得到准确的结果，使得检测更 为精准。利用质粒对实验结果做进一步检测，保证实验结果的准确性。 附图说明 图1为本发明实施例1试剂盒结构示意图； 图2为本发明实施例2试剂盒结构示意图。 附图中，各标号所代表的部件列表如下： 1、盒体，2、第一抽屉式隔层，3、第二抽屉式隔层，4、第三抽屉式隔层，5、第一磁性 锁扣，6、第二磁性锁扣，7、把手，8、泡沫垫，801、第一泡沫垫，802、第二泡沫垫，9、gDNA清除 剂缓冲液，10、gDNA清除剂，11、cDNA逆转录缓冲液，12、cDNA逆转录酶混合物，13、逆转录引 物混合物，14、第一无酶水，15、逆转录使用96孔板，16、探针，17、阳性标准品，18、单独质粒， 19、实时荧光定量聚合酶链式反应液，20、第二无酶水，21、定量聚合酶链式反应使用的96孔 板，22、第一冰盒，23、第二冰盒。