技术摘要：
本发明公开了一种猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，预先包被的ELISA反应板以猪星状病毒Capside保守区蛋白(pGEX‑4T‑1‑cap‑1蛋白)作为包被抗原。试验证明，本发明猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，能准确灵敏地检测猪血清中的性抓个病毒抗 全部
背景技术：
近年来在国内外的养殖场中，猪星状病毒(porcine astrovirus，PAstV)常与其他 肠道病毒混合感染引起仔猪腹泻，并造成不小的经济损失。PAstV Capside可以刺激机体产 生免疫应答，是研究检测诊断试剂的首选蛋白。 猪星状病毒的诊断较为常见的方法有流行病学、分子诊断及病毒分离诊断等，但 这些方法中有的诊断时间较长，有的检测结果不理想，有的不便于临床大量检测。ELISA方 法具有快速定性和定量、灵敏度高、适用范围广、结果判定客观、成本低和可同时进行数千 份样品的检测等优点。目前，国内外并没有关于猪星状病毒相关ELISA检测试剂盒的产品报 道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确 度、操作简单的星状病毒间接ELISA检测试剂盒，以便于实现猪星状病毒的批量、快速血清 学检测。 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案： 猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，预先包被的 ELISA反应板以猪星状病毒Capside保守区蛋白作为包被抗原。 猪星状病毒Capside保守区蛋白由序列表SEQ.ID.No.1的基因碱基序列编码或者 具有SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。 上述猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，还包括标准阴性血清、标准阳性血清、辣 根过氧化物酶HRP标记山羊抗猪IgG、洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、底物液、终止液。 洗涤液和稀释液均为PBST洗涤液；包被液为PH9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液；封闭液 为5％胎牛血清；底物液为TMB显色液；终止液为2mol/L的硫酸溶液。 洗涤液和稀释液均为PBST洗涤液，按以下进行配制：将准确称量的8g NaCl、0.2g KCl、2.9g Na2HPO4.12H2O和0.2g KH2PO4充分溶解在800mL去离子水中，然后将pH值调节到7， 然后加去离子水定容至1L，再加入500μL Tween-20； 包被液为pH9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液，按以下进行配制：将1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3加水充分溶解后，将pH调到9.6后，加去离子水定容为1L，即得； 底物液为TMB显色液，包括TMB显色A液和B液，使用前进行1：1配制。 包被抗原按以下方法进行制备：根据猪星状病毒全长感染性克隆质粒为模板，利 用设计合成的特异性引物对猪星状病毒I型Capsid基因保守区进行PCR扩增，并将目的基因 回收连接到pGEX-4T-1质粒中，经鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导后 3 CN 111551750 A 说 明 书 2/6 页 采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况；亲和层析法分离纯化得到目的蛋白pGEX-4T-1-cap- 1蛋白。 特异性引物包括序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列。 预先包被的ELISA反应板按以下方法进行制备：取100μl用包被液稀释至工作浓度 的包被抗原加入ELISA反应板的反应孔中，37℃包被2h，用100μl封闭液37℃封闭2小时；工 作浓度为200μg/孔。 针对目前现有猪星状病毒诊断检测存在的问题，发明人设计并制备了一种猪星状 病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，预先包被的ELISA反应板以猪星 状病毒Capside保守区蛋白(pGEX-4T-1-cap-1蛋白)作为包被抗原。其分析原理是：酶标板 上的每个孔均包被有相同量的抗原，加入稀释好的待测样品(血清)，样品中的capside抗体 能够通过抗原抗体反应给合到固相上，再加入酶标二抗，当样品中的针对pGEX-4T-1-cap-1 蛋白的抗体浓度高的时候，结合的抗体就越多，结合的酶标二抗体就越多，用洗涤液洗涤后 加入显色液，显色反应就越深，用酶标仪检测的OD值越高，表明待测样品中的capside抗体 含量越高，当反应的OD值高于临界值时，就判定为阳性；反之，则为阴性。 该试剂盒涉及星状病毒衣壳蛋白作为星状病毒唯一的结构蛋白，不仅是病毒刺激 受感染机体产生保护性免疫反应的主要因素，也是该病毒的抗原蛋白。发明人前期研究表 明，在猪星状病毒衣壳蛋白序列中，1aa-419aa区间相对保守，对其进行抗原表位预测，发现 1aa-150aa存在抗原表位的可能性较高，因此选取该蛋白相对保守的1aa-150aa片段进行扩 增，克隆表达猪星状病毒衣壳蛋白保守区片段并建立相应的间接ELISA检测方法能够更特 异、灵敏地判断是否存在猪星状病毒感染和定量感染后引起的抗体滴度，可以为猪星状病 毒的血清学早期诊断提供一种快速准确的方法。 试验证明，本发明猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，能准确灵敏地检测猪血清中 的性抓个病毒抗体，从而对样品进行定性判断。而且，样品前处理过程简单，耗时少，敏感性 好，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。综上，本发明对解 决大批量样品的猪星状病毒现场检测技术具有重要的现实意义。 附图说明 图1是cap-1扩增结果图，图中：M是DL1000 DNA Marker；1-3是cap-1片段；4是阴性 对照。 图2是重组质粒的酶切鉴定结果图，图中：M是DL5000 DNA Marker；1是pGEX-4T-1- cap-1重组质粒；2是pGEX-4T-1空载。 图3是重组蛋白表达结果图，图中：M是Marker；1是pGEX-4T-1-cap-1重组蛋白；2是 pGEX-4T-1空载。 图4是重组蛋白表达形式确定结果图，图中：M是Marker；1是pGEX-4T-1-cap-1诱导 上清；2是pGEX-4T-1-cap-1诱导沉淀。 图5是重组蛋白纯化结果图，图中：M是Marker；1是流穿液；2是洗涤液；3是洗脱液。 图6是重组蛋白透析后WB验证结果图，图中：M是Marker；1是透析后蛋白；2是pGEX- 4T-1空载对照。 4 CN 111551750 A 说 明 书 3/6 页
本发明公开了一种猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，预先包被的ELISA反应板以猪星状病毒Capside保守区蛋白(pGEX‑4T‑1‑cap‑1蛋白)作为包被抗原。试验证明，本发明猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，能准确灵敏地检测猪血清中的性抓个病毒抗 全部
背景技术：
近年来在国内外的养殖场中，猪星状病毒(porcine astrovirus，PAstV)常与其他 肠道病毒混合感染引起仔猪腹泻，并造成不小的经济损失。PAstV Capside可以刺激机体产 生免疫应答，是研究检测诊断试剂的首选蛋白。 猪星状病毒的诊断较为常见的方法有流行病学、分子诊断及病毒分离诊断等，但 这些方法中有的诊断时间较长，有的检测结果不理想，有的不便于临床大量检测。ELISA方 法具有快速定性和定量、灵敏度高、适用范围广、结果判定客观、成本低和可同时进行数千 份样品的检测等优点。目前，国内外并没有关于猪星状病毒相关ELISA检测试剂盒的产品报 道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确 度、操作简单的星状病毒间接ELISA检测试剂盒，以便于实现猪星状病毒的批量、快速血清 学检测。 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案： 猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，预先包被的 ELISA反应板以猪星状病毒Capside保守区蛋白作为包被抗原。 猪星状病毒Capside保守区蛋白由序列表SEQ.ID.No.1的基因碱基序列编码或者 具有SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。 上述猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，还包括标准阴性血清、标准阳性血清、辣 根过氧化物酶HRP标记山羊抗猪IgG、洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、底物液、终止液。 洗涤液和稀释液均为PBST洗涤液；包被液为PH9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液；封闭液 为5％胎牛血清；底物液为TMB显色液；终止液为2mol/L的硫酸溶液。 洗涤液和稀释液均为PBST洗涤液，按以下进行配制：将准确称量的8g NaCl、0.2g KCl、2.9g Na2HPO4.12H2O和0.2g KH2PO4充分溶解在800mL去离子水中，然后将pH值调节到7， 然后加去离子水定容至1L，再加入500μL Tween-20； 包被液为pH9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液，按以下进行配制：将1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3加水充分溶解后，将pH调到9.6后，加去离子水定容为1L，即得； 底物液为TMB显色液，包括TMB显色A液和B液，使用前进行1：1配制。 包被抗原按以下方法进行制备：根据猪星状病毒全长感染性克隆质粒为模板，利 用设计合成的特异性引物对猪星状病毒I型Capsid基因保守区进行PCR扩增，并将目的基因 回收连接到pGEX-4T-1质粒中，经鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导后 3 CN 111551750 A 说 明 书 2/6 页 采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况；亲和层析法分离纯化得到目的蛋白pGEX-4T-1-cap- 1蛋白。 特异性引物包括序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列。 预先包被的ELISA反应板按以下方法进行制备：取100μl用包被液稀释至工作浓度 的包被抗原加入ELISA反应板的反应孔中，37℃包被2h，用100μl封闭液37℃封闭2小时；工 作浓度为200μg/孔。 针对目前现有猪星状病毒诊断检测存在的问题，发明人设计并制备了一种猪星状 病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，预先包被的ELISA反应板以猪星 状病毒Capside保守区蛋白(pGEX-4T-1-cap-1蛋白)作为包被抗原。其分析原理是：酶标板 上的每个孔均包被有相同量的抗原，加入稀释好的待测样品(血清)，样品中的capside抗体 能够通过抗原抗体反应给合到固相上，再加入酶标二抗，当样品中的针对pGEX-4T-1-cap-1 蛋白的抗体浓度高的时候，结合的抗体就越多，结合的酶标二抗体就越多，用洗涤液洗涤后 加入显色液，显色反应就越深，用酶标仪检测的OD值越高，表明待测样品中的capside抗体 含量越高，当反应的OD值高于临界值时，就判定为阳性；反之，则为阴性。 该试剂盒涉及星状病毒衣壳蛋白作为星状病毒唯一的结构蛋白，不仅是病毒刺激 受感染机体产生保护性免疫反应的主要因素，也是该病毒的抗原蛋白。发明人前期研究表 明，在猪星状病毒衣壳蛋白序列中，1aa-419aa区间相对保守，对其进行抗原表位预测，发现 1aa-150aa存在抗原表位的可能性较高，因此选取该蛋白相对保守的1aa-150aa片段进行扩 增，克隆表达猪星状病毒衣壳蛋白保守区片段并建立相应的间接ELISA检测方法能够更特 异、灵敏地判断是否存在猪星状病毒感染和定量感染后引起的抗体滴度，可以为猪星状病 毒的血清学早期诊断提供一种快速准确的方法。 试验证明，本发明猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，能准确灵敏地检测猪血清中 的性抓个病毒抗体，从而对样品进行定性判断。而且，样品前处理过程简单，耗时少，敏感性 好，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。综上，本发明对解 决大批量样品的猪星状病毒现场检测技术具有重要的现实意义。 附图说明 图1是cap-1扩增结果图，图中：M是DL1000 DNA Marker；1-3是cap-1片段；4是阴性 对照。 图2是重组质粒的酶切鉴定结果图，图中：M是DL5000 DNA Marker；1是pGEX-4T-1- cap-1重组质粒；2是pGEX-4T-1空载。 图3是重组蛋白表达结果图，图中：M是Marker；1是pGEX-4T-1-cap-1重组蛋白；2是 pGEX-4T-1空载。 图4是重组蛋白表达形式确定结果图，图中：M是Marker；1是pGEX-4T-1-cap-1诱导 上清；2是pGEX-4T-1-cap-1诱导沉淀。 图5是重组蛋白纯化结果图，图中：M是Marker；1是流穿液；2是洗涤液；3是洗脱液。 图6是重组蛋白透析后WB验证结果图，图中：M是Marker；1是透析后蛋白；2是pGEX- 4T-1空载对照。 4 CN 111551750 A 说 明 书 3/6 页
