技术摘要：
本发明涉及一种能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法，通过使用特定浓度的胰蛋白酶为主体配制分离液针对免疫磁珠和外泌体之间起连接作用的抗体蛋白进行消化并使免疫磁珠和外泌体分离，从而将外泌体从免疫磁珠上分离，同时保持外泌体的完整性以及生物活性，其所包含的  全部
背景技术：
外泌体(Exosome)：是大多数细胞都会分泌的一类直径在30-150nm的盘状囊泡，它 包含有多种核酸以及蛋白质等物质，可进行细胞间的信息交换。在细胞胞吐形成外泌体时， 细胞中的多种蛋白质、脂质、RNA以及一些融合基因等分子会选择性地进入到这些囊泡中， 因此外泌体就携带了母细胞来源的诸多生物学信息。另一方面，外泌体具有与细胞相同的 膜结构，即磷脂双分子层，可以很好地保护其携带的蛋白、核酸不受外界影响而能够保持其 原本性质。 目前越来越多的研究表明，外泌体内物质与人类多种疾病的发生、发展有着密切 的关系。外泌体提取的金标准方法是梯度超速离心法，但该方法耗时长、费人力、实验设备 昂贵不利于研究的开展。免疫磁珠法可以特异性地快速捕获体液样本中的外泌体，结合自 动化设备可完成外泌体的全自动化提取。 免疫磁珠捕获外泌体的方法最终所得到的均是外泌体-磁珠复合物，例如国内专 利：CN107893051A、CN109738625A、CN106289926A等，这些专利均是利用磁珠捕获外泌体后 得到外泌体-磁珠的复合物，该复合物并不能很好的进行如TEM、NTA等表征检测，也就无法 充分的证明磁珠所捕获的是外泌体而不是其他囊泡。目前并没有一种合适的方法在保证外 泌体完整性的前提下将外泌体从免疫磁珠上分离下来，现有技术如高浓度盐溶液、极低pH 盐溶液或强蛋白变性剂均是直接将磁珠上的外泌体进行裂解，从而达到分离，均不能得到 结构完整的外泌体。 因此，国内亟需一种既可以简便快速，又可以保证外泌体完整性的方法将外泌体 从免疫磁珠上进行分离。目前现有的外泌体-磁珠分离方法还有提升空间，亟待开发出可保 护外泌体完整性的分离方法。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明提出一种能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方 法，通过使用消化效果较温和可控的胰蛋白酶为主体配制分离液，针对免疫磁珠和外泌体 之间起连接作用的抗体蛋白进行消化并使免疫磁珠和外泌体分离，同时避免在消化过程中 损坏外泌体结构、破坏外泌体内部蛋白。 为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括： 一种能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、免疫磁珠-外泌体复合物重悬液中依照1mg免疫磁珠-外泌体复合物对应2～ 100μg胰蛋白酶的配比加入胰蛋白酶混匀，得到消化组合物； S2、将所述消化组合物置于温度范围20℃至40℃(可采用恒温水浴)进行消化反 3 CN 111575228 A 说　明　书 2/5 页 应，持续时间1至10分钟，得到第一分离组合物； S3、向所述第一分离组合物内添加等量于胰蛋白酶加入量的胰蛋白酶抑制剂并混 合均匀，得到第二分离组合物； S4、对所述第二分离组合物进行磁分离，所得上清部分即为外泌体溶液。 进一步地，所述免疫磁珠-外泌体复合物重悬液包括采用PBS溶剂的重悬液。 进一步地，所述步骤S1包括依照1mg免疫磁珠-外泌体复合物对应25μg胰蛋白酶的 配比加入胰蛋白酶混合，得到消化组合物。 进一步地，所述步骤S2包括将所述消化组合物置于恒温37℃中进行消化反应，持 续时间3分钟，得到第一分离组合物。 进一步地，所述步骤S1中加入胰蛋白酶混合包括加入胰蛋白酶水溶液；所述胰蛋 白酶水溶液包括溶解有胰蛋白酶的不含二价金属离子的水溶液。 进一步地，所述胰蛋白酶包括猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶、羊胰蛋白酶或基因工程表 达的胰蛋白酶；所述胰蛋白酶抑制剂包括大豆胰蛋白酶抑制剂。 进一步地，所述免疫磁珠包括粒径10nm至10μm的免疫磁珠；所述免疫磁珠包括带 有以下表面包被抗体：CD9、CD63、CD81、CD44、CD31、Rab5b、EpCAM、TSG101、HSP90、HSP70、 ANXA5、FLOT1、ICAM1、ALIX、GM130、ICAM-1、SNAP、MHC  I/II、HLA-G、Integrins、Claudins、 Tim4，且所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。 进一步地，还包括上述方法在血浆、血清、尿液、乳汁、脑脊液、肿瘤腹水、唾液、细 胞培养上清中分离外泌体的应用。 本发明的有益效果为： 采用本发明所述能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法处理捕获有外泌体的 免疫磁珠，通过使用特定浓度的胰蛋白酶对免疫磁珠表面抗体进行针对性消化，从而将外 泌体从免疫磁珠上分离，同时保持外泌体的完整性以及生物活性，其所包含的内容物如蛋 白、核酸等不受破坏，可以进一步用于外泌体形态、生物活性等研究以及TEM、NTA等表征检 测方法。本发明所述的分离方法操作环境温和，操作方法简单、可控性高，且分离得到的外 泌体具有较高的纯度，分离过程中添加的各种试剂不会影响后续检测分析，是一种快速、高 效的免疫磁珠分离方法。 附图说明 图1为免疫磁珠捕获外泌体操作过程示意图。 图2为本发明能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法流程示意图。 图3为本发明实施例中所获得外泌体的B2M含量与现有技术对比图。 图4为本发明实施例中所获得外泌体的HSP70蛋白显影图。 图5为本发明实施例中所获得外泌体的CD9蛋白显影图。 图6为本发明实施例中所获得外泌体的第一TEM显微图。 图7为本发明实施例中所获得外泌体的第二TEM显微图。 图8为本发明实施例中所获得外泌体的粒径-浓度图。 4 CN 111575228 A 说　明　书 3/5 页