技术摘要：
本发明提供了一种检测水痘‑带状疱疹病毒(VZV)病毒滴度的抗体及相关检测方法，包括将二倍体细胞接种于96孔板中进行培养，然后感染接种未知病毒滴度的样品，经过培养后，通过加入所述特异性结合VZV病毒的抗体、FITC标记的二抗，进行荧光染色，镜下观察被感染后的病变数  全部
背景技术：
： 水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster  virus，VZV)，属于人疱疹病毒属，人类疱 疹病毒3型。最早由日本学者高桥(Taka-hashiM)于1971年从水痘患儿的皮肤疱疹液中分离 得到。后续研究表明，VZV属疱疹病毒α亚科，为双链DNA病毒，由124.9kb组成，直径为150～ 200nm，含71个基因组，编码67种蛋白，但病毒本身只有一个血清型，具有嗜神经性。VZV没有 动物储存宿主，人是唯一自然宿主。皮肤是病毒的主要靶器官。人类初次感染VZV会引发水 痘，随后VZV会潜伏在神经节中，当机体免疫力下降时，再次激活引起带状疱疹。 VZV感染表现两种不同的临床症状。初次感染一般发生于儿童，表现为水痘，其后 病毒进入背根神经节并潜伏，在免疫力衰退或免疫抑制等情况下，病毒可能会将被重新激 活，表现为带状疱疹(Zerboni,L.等人,2014.NatRev  Microbiol12(3):197-210)。带状疱疹 常伴随疱疹后神经痛，疱疹后神经痛疼痛剧烈，可持续数年之久，极大影响患者生活质量。 带状疱疹及疱疹后神经痛的发生概率随年龄增大而增大，这给老龄化社会造成了较大的社 会负担。 当前对于水痘带状疱疹病毒感染最主要的预防措施为注射疫苗。当前市场上有水 痘减毒活疫苗来预防水痘，重组亚单位带状疱疹疫苗和带状疱疹减毒活疫苗来预防带状疱 疹(Brisson,M.etal,2003.J  Med  Virol  70suppl  1:S31-37；Oxman,N.etal,2005.N  Med  352(22):2271-2284)对于已经发病的个体，当前并没有有效的、特异的治疗手段，而只是通 过抗病毒药物来进行治疗。虽然疫苗和系统性抗病毒剂都已带来重大改进，但是该疾病仍 持续存在。更有效地检测和阻断VZV在种群中感染和繁殖的新抗体和抗体片段的鉴定以及 生产，对于建立这种感染性疾病的治疗和/或预防的改进治疗是特别重要的。 对于疫苗企业来说，水痘减毒活疫苗的疫苗滴度的检测是非常重要的。蚀斑法是 目前我国使用的对水痘病毒滴度测定的常规方法，其简要过程如下：首先在6孔板内接种细 胞，一般为2x105-4x105/ml，每孔接种3ml；37℃、5％CO2条件下培养3天；接种病毒；37℃、5％ CO2条件下培养7天；最后用考马斯亮蓝染色，人工计数每孔噬斑数量。 噬斑法滴度检测方法滴定复孔数是2个，存在复孔数不足带来的方法上的不准确 性；噬斑法整个流程检测时间为10天，不能短时间得到实验结果；噬斑法需要实验人员用肉 眼计数斑点，人为误差难于控制。因此，目前急需一种能够快速准确的检测水痘-带状疱疹 病毒滴度的方法。 本发明人将荧光免疫方法的灵敏性、特异性应用于病毒滴度检测上，开发了一种 用于水痘带状疱疹病毒滴度检测的方法。荧光法是利用抗原抗体结合的特异性和荧光法的 高灵敏性相结合的方法应用于病毒滴度检测领域。首先该方法在实验中可以设置4-8个复 孔，显著提高滴度检测的准确性；其次该方法整个实验流程耗时为5天，相比于噬斑法全程 4 CN 111579789 A 说　明　书 2/6 页 需要10天，实验时间减少一半；再次该方法可以在荧光酶联免疫斑点分析仪上自动读板计 数，实现了自动化，减少了人工成本，降低了劳动强度和实验的人为误差；再有该方法的自 动化读板和计数符合GMP数据完整性的要求。该方法具有快速、特异、准确、通量高，可以自 动化计数等优点，可望成为水痘带状疱疹病毒滴度检测的备选(替代)方法。两种方法的比 较见下表。 噬斑法与荧光法的比较 本发明人在进行VZV病毒相关抗体研究过程中，对已有针对VZV包膜蛋白gE的抗体 进行突变，得到一种突变的抗体，并意外发现该突变抗体尤其适合用于VZV病毒滴度的检 测，尤其用于荧光法检测时，能够取得与传统蚀斑法相当的准确度，但其检测时间却显著缩 短。 因此，本申请提供一种检测水痘-带状疱疹病毒滴度的荧光检测方法；所述方法检 测迅速、准确，便于产业化应用。
技术实现要素：
本发明提供了一种水痘-带状疱疹病毒检测的新方法，利用抗原抗体特异性结合 的特点，结合荧光信号检测的高灵敏度的优势，本发明方法检测更快捷、准确。而且能够使 用仪器读板，减少人为判定误差。 具体的，本发明涉及一种检测水痘-带状疱疹病毒滴度的荧光检测方法，其特征在 于，所述方法包括以下步骤： (1)将二倍体细胞接种于96孔板中，并置于二氧化碳孵箱培养； (2)将备检病毒样品经稀释后接种至上述96孔板，补加维持液后继续置于二氧化 碳孵箱培养； (3)将步骤(2)中经培养后96孔板取出，弃去培养液后，经固定液固定后，加入一抗 孵育，所述一抗为特异性VZV单抗； (4)步骤(3)中经一抗孵育的96孔板经洗涤后，加入荧光标记的二抗继续孵育，所 述二抗为抗种属抗体； (5)步骤(4)中经二抗孵育的96孔板经洗涤后，用荧光定量检测仪进行检测，计算 样品的病毒滴度。 本发明所述二倍体细胞为任选的对水痘-带状疱疹病毒敏感的二倍体细胞，优选 为人胚肺二倍体细胞2BS细胞株、或MRC-5细胞株、或KMB-17细胞株；更有选为人胚肺二倍体 细胞2BS细胞株。 5 CN 111579789 A 说　明　书 3/6 页 本发明所述检测的病毒为水痘-带状疱疹病毒，包括减毒水痘带状疱疹病毒和未 减毒的水痘带状疱疹病毒。 本发明所述的特异性VZV抗体为针对VZV及其糖蛋白E(VZV-gE)、糖蛋白B(VZV- gB)、糖蛋白H(VZV-gH)的多克隆抗体和单克隆抗体。 本发明所述的二抗为经荧光素标记的抗种属抗体，包括抗鼠(mouse)、抗鼠 (rats)、抗兔和抗人的抗种属抗体。 本发明所述的步骤(1)中的细胞接种数为2×105-5×105/ml，培养条件为35-40℃、 二氧化碳浓度为4-6％，培养时间为20-48小时。 本发明所述步骤(2)中培养条件为35-40℃、二氧化碳浓度为4-6％，培养时间为 48-96小时。 进一步的，优化条件为，步骤(1)细胞接种数为2×105-4×105/ml，培养条件为37 ℃、二氧化碳浓度为5％，培养时间为24小时； 进一步的，优化条件为，步骤(2)中培养条件为37℃、二氧化碳浓度为5％，培养时 间为72小时。 本发明所述步骤(2)中所述稀释为经稀释液稀释，稀释后每孔接种50微升，每个稀 释度接种4-8孔；所述稀释液为：PBS 50％蔗糖 10％谷氨酸钠 10％胎牛血清，或者MEM 2％ 新生牛血清 1％谷氨酰胺 2％NaHCO3。 本发明所述步骤(2)中所述稀释为经稀释液稀释，稀释每50微升含有病毒数量为 2-50PFU。 进一步的，优化条件为，所述步骤(2)中，每50ul含有病毒数量为5-30PFU。 本发明所述步骤(2)中的维持液的配方为：MEM 5％新生牛血清 1％谷氨酰胺，每 孔补加150微升维持液。 本发明所述步骤(3)中的固定液为90％乙醇 10％甲醛；所述固定为每孔100-300 微升固定液，室温放置10-30分钟。 进一步的，优化条件为，所述步骤(3)中的固定液为90％乙醇 10％甲醛；所述固定 过程优化为，每孔加入固定液100微升，固定条件为室温放置15分钟。 本发明所述步骤(3)中的一抗孵育条件为：37℃或者25℃或者室温，孵育0.5-2小 时；或者2-8℃，孵育18-24小时。 进一步的，优化条件为孵育温度为37℃，孵育时间为1h。 本发明所述步骤(4)中的二抗孵育条件为：37℃或者25℃或者室温，孵育0.5-2小 时或者2-8℃，孵育18-24小时。 进一步的，优化条件为孵育温度为37℃，孵育时间为0.5h。 本发明所述步骤(3)和(4)中的洗涤过程使用的洗液为PBST洗涤液，其配方为：PBS 0.5‰-2‰Twwen20；洗涤次数为2-5次。 进一步的，优化条件为洗涤液为PBS 1‰Twwen20，洗涤次数为3次。 本申请发明人在研究中发现，虽然荧光法在多方面优于蚀斑法，但仍存在检测结 果不稳定等现象，研究发现存在因现有特异性VZV抗体与抗原结合能力不稳定等因素导致， 推测所述抗体在培养的单层细胞中与抗原VZV的结合受到细胞环境影响，导致其结合不稳 定，并导致检测结果出现不稳定。对此，本申请发明人通过随机突变方式得到本发明的突变 6 CN 111579789 A 说　明　书 4/6 页 型抗VZV抗体，所述突变型抗VZV抗体相比与野生型，获得了改进的抗原结合特性，在实验中 表明，能够与VZV稳定结合，用于本申请的检测方法，能够取得与传统蚀斑法相当的检测准 确度，但能够显著缩减检测时间，取得了令人惊讶的技术效果。本申请发明人在研究中选择 以申请号CN201510884880.8中公开的抗VZV抗体为原型(定义为野生型抗体)，进行突变筛 选，得到所述抗体为人IgG型抗体，其恒定区为人IgG恒定区。所述抗体的轻链可变区序列如 SEQ  ID  No：3所示，所述抗体重链可变区序列如SEQ  ID  No：4所示。 本发明方法与现有的病毒滴度检测方法相比，主要具有以下几方面的优点： (1)检测速度快，相比于传统蚀斑法检测需要10天，用该方法检测只需要5天。 (2)检测通量大，可以机器读板，自动化程度高，显著减少人为判定的劳作强度； (3)操作简便、快速，检测准确度高，能够取得与传统蚀斑法相当的检测准确度。 (4)特异性强。 附图说明 图1：本发明荧光检测方法96孔板单孔检测图； 图2：本发明荧光检测方法中使用荧光检测仪检测96孔板检测图。