技术摘要：
本发明涉及一种亲水作用色谱‑反相色谱组合二维液相系统及其分析方法，该系统包括亲水作用色谱柱、反相色谱柱、检测器、自动进样器、第一泵组件、第二色谱泵、第三色谱泵、混合器、样品环和切换阀；所述第一泵组件与所述亲水作用色谱柱接通，所述第二色谱泵和第三色谱  全部
背景技术：
在代谢组学、环境、农兽残分析等领域，通常需要分析多种目标物质，当各目标物 极性差异过大时，则难以用一个方法完成对所有物质的分析。面对这一问题，通常是采用两 种分析方法、两种色谱柱(如亲水作用色谱柱和反相色谱柱)分别完成强极性物质和弱极性 物质的分析。这样的处理方式耗时耗力，且会产生多一倍的冗余数据，不利于提高分析效 率。 在线二维液相色谱系统，是通过管路的连接、阀的切换将不同的特性的色谱柱连 接在一起，从而将第一维无法分离的物质导入第二维进一步分析，提高分离度与峰容量。基 于原理及连接方式的区别，二维液相色谱系统种类多样。随着技术的不断成熟，二维液相色 谱系统已越来越多地用于复杂样品的分析。
技术实现要素：
本发明提供一种亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统，该系统以切换阀作 为连接中枢，将亲水作用色谱与反相色谱连接起来，实现对极性差异较大的多组分目标物 的一次性分析。 本发明采取的技术方案如下： 一种亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统，包括亲水作用色谱柱、反相色谱 柱、检测器、自动进样器、第一泵组件、第二色谱泵、第三色谱泵、混合器、样品环和切换阀； 所述第一泵组件用于推送载样溶液以及对亲水作用色谱柱梯度洗脱，所述第一泵 组件的出口与所述亲水作用色谱柱的入口接通，所述自动进样器设于所述第一泵组件与亲 水作用色谱柱之间的连接管路上； 所述第二色谱泵和第三色谱泵用于对反相色谱柱梯度洗脱，所述第二色谱泵的出 口通过所述切换阀与所述混合器的入口接通，所述第三色谱泵的出口与所述混合器的入口 接通，所述混合器的出口与所述反相色谱柱的入口接通； 所述亲水作用色谱柱的出口、所述反相色谱柱的出口、所述检测器的入口以及所 述样品环的两个端口，分别与所述切换阀连接； 所述切换阀通过其位置切换至少具备以下2种连接状态： 连接状态1：所述切换阀将所述检测器的入口与所述亲水作用色谱柱的出口接通， 并将所述样品环的一个端口与所述第二色谱泵的出口接通，另一个端口与所述混合器的入 口接通； 连接状态2：所述切换阀将所述检测器的入口与所述反相色谱柱的出口接通，并将 所述样品环的一个端口与所述亲水作用色谱柱的出口接通，另一个端口连接至系统外。 4 CN 111610264 A 说　明　书 2/11 页 通过该切换阀的切换，能够先后实现亲水作用色谱模式(第一维)和反相色谱模式 (第二维)；所述切换阀切换至该连接状态1时，系统的流路可完成亲水作用色谱柱上样或强 极性物质分离检测的过程，所述切换阀切换至该连接状态2时，系统的流路可完成弱极性物 质收集或弱极性物质分离检测的过程。 本发明所述的亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统，以切换阀作为连接中 枢，将亲水作用色谱柱与反相色谱柱连接起来，所述亲水作用色谱柱具有保留、分离强极性 物质的特性，而所述反相色谱柱具有保留、分离弱极性物质的特性。本发明使用简单的硬件 设备和连接流路设计得到的所述系统，实现了一针进样完成对弱极性到强极性物质的分 离，并可以与紫外检测器或质谱检测技术联用进行分析。 具体地，所述切换阀由两个六通阀连接组成。 具体地，所述切换阀为一个十通阀，系统的搭建更加简单。 具体地，所述样品环的两个端口分别为第一端口和第二端口；在所述连接状态1 中，所述切换阀将所述样品环的第一端口与所述第二色谱泵的出口接通，将所述样品环的 第二端口与所述混合器的入口接通；在所述连接状态2中，所述切换阀将所述样品环的第二 端口与所述亲水作用色谱柱的出口接通，将所述样品环的第一端口连接至系统外。 通过该配置，亲水作用色谱模式中第一色谱泵输送溶剂将亲水作用色谱柱中的待 测组分洗脱至样品环的方向，与后续反相色谱模式中第二色谱泵输送的有机溶剂进入样品 环将待测组分推入混合器的流动方向相反，有利于待测组分快速进入反相色谱柱聚焦。 具体地，所述混合器为三通混合器，具有三个端口，其中的两个端口为所述混合器 的入口，分别通过管路与所述第三色谱泵的出口以及所述切换阀接通，其余的一个端口为 所述混合器的出口，通过管路与所述反相色谱柱的入口接通。 具体地，所述第一泵组件包括第一色谱泵和内置于该第一色谱泵中的低压梯度比 例阀；或者等效地，所述第一泵组件为包括两个色谱泵的二元高压梯度系统。所述第一泵组 件具有至少输送两种极性相异的溶剂的能力，可以完成第一维液相的梯度洗脱。 所述系统中，在第一维，第一泵组件可以自由选择“一个泵 梯度比例阀”或者“两 个泵”的组合，这两种配置都可以达到先混合再进样，以实现第一维的梯度分离； 在第二维，采用第二色谱泵和第三色谱泵组成二元高压梯度系统，通过前述特定 的流路设计，达到先进样再混合，以解决第二维中溶剂效应的问题。具体地，在第二维液相 中，“切换阀 样品环”组成了等效的进样系统，假设样品环体积为500μL，溶剂为高比例ACN (乙腈)，它对于反相色谱柱来说是强溶剂，如果采用普通的“先混合再进样”进样方式，则是 流动相推着一段500μL  ACN液段进入反相色谱柱，从而引起很强的溶剂效应。本发明的解决 办法是，先由第二色谱泵输送小流速ACN将储存于样品环中的溶液带出(先进样)，然后在混 合器处与第三色谱泵输送大流速的水混合(后混合)，从而500μL  ACN被大量的水稀释成高 比例水相的溶液，此时再进入反相色谱柱，则不会产生溶剂效应。 本发明还提供上述系统的分析方法，包括如下步骤： 1)亲水作用色谱柱上样，反相色谱柱平衡： 切换阀调整至将检测器的入口与亲水作用色谱柱的出口接通的状态，然后自动进 样器将样品导入系统中，第一泵组件输出高比例有机溶剂推送样品进入亲水作用色谱柱， 使样品保留在亲水作用色谱柱柱头，该高比例有机溶剂经过切换阀进入检测器；同时，第二 5 CN 111610264 A 说　明　书 3/11 页 色谱泵和第三色谱泵分别输送水相溶剂进入混合器中混合，形成高比例水相混合溶剂进入 反相色谱柱； 2)弱极性物质收集： 第一泵组件输送溶剂中水相溶剂的比例提升，将样品中的弱极性物质从亲水作用 色谱柱中洗脱，切换阀切换至连接状态2，使洗脱出的弱极性物质经过切换阀导入样品环 中；同时，第二色谱泵和第三色谱泵保持步骤1)的状态； 3)强极性物质分离，弱极性物质聚焦： 切换阀切换至连接状态1，第一泵组件输送溶剂中水相溶剂的比例继续提升，将保 留在亲水作用色谱柱上的强极性物质梯度洗脱，强极性物质经切换阀进入检测器中检测； 同时，第二色谱泵输出有机相溶剂经切换阀将样品环内的弱极性物质推送至混合器，第三 色谱泵输送水相溶剂进入混合器，混合器中形成携带弱极性物质的高比例水相混合溶剂进 入反相色谱柱，该弱极性物质在反相色谱柱柱头聚焦，该高比例水相混合溶剂经切换阀排 出系统外； 4)亲水作用色谱柱平衡，弱极性物质分离： 亲水作用色谱柱上的强极性物质分离、检测完成后，切换阀切换至连接状态2，第 一色谱泵输送高比例有机相溶剂进入亲水作用色谱柱，从亲水作用色谱柱出去的溶剂经过 样品环和切换阀排出系统外；同时，第二色谱泵和第三色谱泵分别输送水相溶剂进入混合 器中混合，形成的高比例水相混合溶剂进入反相色谱柱，随时间推移提升该混合溶剂中有 机相溶剂的比例，将聚焦于反相色谱柱柱头的弱极性物质逐个洗脱，弱极性物质经切换阀 进入检测器中检测； 5)返回初始状态： 反相色谱柱上的所有物质被洗脱至检测器后，系统恢复至步骤1)的状态，等待下 一针样品进样。 具体地，步骤2)中，切换阀在第一个组分从亲水作用色谱柱流出之前切换至连接 状态2，使洗脱出的弱极性物质及时导入样品环中；步骤3)中，切换阀在样品环被亲水作用 色谱柱的流出物充满之前切换至连接状态1，以免最初流出的组分排入废液。 具体地，步骤1)和步骤4)中，第一泵组件输送的高比例有机溶剂中有机相溶剂的 体积比例大于95％；步骤1)至3)中，混合器中形成的高比例水相混合溶剂中的水相溶剂的 体积比例始终大于90％，步骤4)中，混合器内形成的混合溶剂中，有机相溶剂的体积比例梯 度提升至大于95％。 通过上述配置，调整各步骤中各泵装置输送溶剂的极性和洗脱能力，从而达到推 送待测物质或梯度洗脱色谱柱上待测物质的效果。此外，在步骤3)中，先由第二色谱泵输送 少量有机相溶剂将储存于样品环中的溶液带出(先进样)，然后在混合器处与第三色谱泵输 送的大量水相溶剂混合(后混合)，从而形成高比例水相混合溶剂再进入反相色谱柱，消除 了溶剂效应。 具体地，步骤2)与步骤3)中样品环内的液相流动方向相反，并通过设定合适的切 阀时间，步骤3)中切换阀在待测物质恰好完全进入样品环时就开始反冲，如果此时样品环 仍未被亲水作用色谱柱的流出物充满，则可以节省样品环的空白尾段被不含样品的流出物 所填充的时间，从而有利于目标组分快速进入反相色谱柱聚焦。 6 CN 111610264 A 说　明　书 4/11 页 相对于现有技术，所述亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统及其分析方法 具有以下优点： (1)一次性分析弱极性与强极性物质，同一样品无需分别用不同的方法分析弱极 性与强极性物质，且只需一个检测器，亲水作用色谱与反相色谱分析所获谱图保存在一个 数据文件中，节省时间，减少冗余数据。 (2)亲水作用色谱与反相色谱两种分析方法在线连接，自动切换，无需手动操作， 提高工作效率；亲水作用色谱柱分离的同时反相色谱柱平衡，反之亦然，宏观上省去了色谱 柱平衡的时间。 (3)本系统的核心连接装置仅为切换阀和样品环，无需捕集柱，最大限度地降低搭 建难度和成本。 (4)除可用于分析弱极性与强极性物质，还可以利用该系统对这两类物质进行分 离，起到在线前处理的作用，即去除极性基质的干扰以分析其中的弱极性物质，或去除非极 性基质的干扰以分析其中的强极性物质。 (5)可依据具体分析项目选择不同的亲水作用色谱柱和反相色谱柱，可拓展性强。 为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。 附图说明 图1本发明提供的亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统的联接示意图； 图2为实施例1的亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统的流路联接图； 图3为实施例1的两个六通阀位于连接状态1时系统的流路联接图； 图4为实施例1的两个六通阀位于连接状态2时系统的流路联接图； 图5为实施例1的两个六通阀位于连接状态3时系统的流路联接图； 图6为实施例2的亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统的流路联接图； 图7为实施例2的十通阀位于连接状态1时系统的流路联接图； 图8为实施例2的十通阀位于连接状态2时系统的流路联接图； 图9为使用实施例2的系统分析8种小分子代谢物和9种脂肪酸得到的色谱图； 图10为使用HILIC色谱柱分析8种小分子代谢物和9种脂肪酸得到的色谱图； 图11为使用普通反相C18色谱柱分析8种小分子代谢物和9种脂肪酸得到的色谱 图； 图12为使用宽极性T3色谱柱分析8种小分子代谢物和9种脂肪酸得到的色谱图； 图中的箭头表示流动方向，附图标记的对应关系为： 1-第一色谱泵；2-第二色谱泵；3-第三色谱泵；4-自动进样器；5-亲水作用色谱柱； 6-第一六通阀；7-第二六通阀；8-混合器；9-样品环；10-反相色谱柱；11-检测器；12-十通 阀。