技术摘要：
本发明提供了一种荧光标记的人三阴性乳腺癌骨转移细胞株，通过下述方法制备而成：一个培养人源三阴性乳腺癌细胞MDA‑MB‑231的步骤；扩增含有红色荧光蛋白RFP的慢病毒载体，制备含有红色荧光标记的MDA‑MB‑231细胞；将RFP‑MDA‑MB‑231细胞移植到裸鼠第四对乳腺脂肪  全部
背景技术：
本世纪以来，全球乳腺癌发病率快速增长，成为城市女性的第一杀手。尽管乳腺癌 早期诊断以及手术技术和放化疗水平的提高降低了乳腺癌死亡率，但恶性乳腺癌伴随肺、 骨、脑等器官转移的致死率仍居高不下。据统计，未治愈的乳腺癌约70％会出现肺转移，约 60％会出现骨转移和肝转移，约15％会出现脑转移。 尤其是三阴性乳腺癌约占乳腺癌的15％，恶性程度极高，易侵袭、易转移。因缺乏 雌激素受体(estrogen  receptor,ER)、孕激素受体(progesterone  receptor,PR)和人表皮 生长因子受体-2(human  epithelial  growth  factor  receptor,HER2)等治疗靶点，一旦发 生扩散和转移，难治愈且预后差。因此，阻止恶性乳腺癌扩散、转移，是从根本上解决恶性乳 腺癌的高致死率的关键点。 MDA-MB-231细胞株是经典的、被全球医学科学家广泛认同并使用的三阴性乳腺癌 细胞。MDA-MB-231细胞恶性程度高，移植小鼠后易成瘤，肿瘤生长速度快，而且容易转移到 肺、骨等器官。 并非所有三阴性乳腺癌细胞都能够发生骨转移。建立具有高骨转移能力的三阴性 乳腺癌细胞，必将有助于鉴定骨转移乳腺癌细胞亚群的基因表达特征，更有助于科学家寻 找乳腺癌骨转移的治疗靶点和干预措施。这是本发明的初衷。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种荧光标记的人三阴性乳腺癌骨转移细胞株，所述的这 种荧光标记的人三阴性乳腺癌骨转移细胞株要解决现有技术中的人三阴性乳腺癌骨转移 细胞株不能可视化和可示踪的技术问题。 本发明提供了一种荧光标记的人三阴性乳腺癌骨转移细胞株，通过下述的方法制 备而成： (1)一个培养人源三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的步骤； (2)扩增含有红色荧光蛋白RFP的慢病毒载体，利用慢病毒转染细胞的方法，转染 MDA-MB-231细胞，制备含有红色荧光标记的MDA-MB-231细胞； (3)通过流式细胞仪分选，获得红色荧光RFP-MDA-MB-231细胞； (4)将RFP-MDA-MB-231细胞移植到裸鼠第四对乳腺脂肪垫位置，然后进行哺育4-6 周成瘤； (5)乳腺肿瘤直径达到0.8-1.2cm时，处死裸鼠，解剖，取后肢胫骨，无菌环境下，用 PH7.4的1x  PBS缓冲溶液冲取骨髓，再采用胶原酶消化，获得骨髓来源单细胞，体外培养扩 增； 3 CN 111593026 A 说　明　书 2/5 页 (6)利用流式细胞分析仪，检测并分选从乳腺肿瘤转移到骨的红色荧光乳腺癌细 胞，体外培养扩增，作为P1代乳腺癌骨转移细胞； (7)扩增P1代乳腺癌骨转移细胞，移植裸鼠，重复上述第4-第6步，获得P2代乳腺癌 骨转移细胞； (8)扩增P2代乳腺癌骨转移细胞，移植裸鼠，重复上述第4-第6步，获得P3代乳腺癌 骨转移细胞； (9)通过上述三轮的裸鼠体内成瘤筛选，得到红色荧光标记的MDA-MB-231人三阴 性乳腺癌骨转移细胞株。 进一步的，上述的一种荧光标记的人三阴性乳腺癌骨转移细胞株，其保藏号为 GDMCC  No：61073。 通过上述的方法，本发明建立了可视化、可示踪的人三阴性乳腺癌骨转移细胞系， 可用于乳腺癌骨转移的机制研究、药物开发、治疗靶点研究等等。 本发明和已有技术比较，其技术进步是显著的。本发明和现有的MDA-MB-231细胞 相比，本发明有荧光蛋白标记，实现了细胞在体内和体外的可视化、可示踪。而且和现有的 MDA-MB-231细胞相比，本发明获得的细胞株完成了小鼠体内三代成瘤和筛选，其骨转移能 力及骨转移特异性比亲本更强。 附图说明 图1显示了红色荧光标记的MDA-MB-231细胞。 图2荷瘤小鼠骨髓细胞的流式细胞分选，有27.5％细胞带有红色荧光。 图3显示了筛选得到的红色荧光标记的骨转移MDA-MB-231-BM细胞。 图4为通过细胞克隆成球实验，显示了MDA-MB-231-BM细胞比亲本MDA-MB-231细胞 有更强的增殖能力。 图5显示了MDA-MB-231-BM细胞比亲本MDA-MB-231细胞有更强的迁移能力。 图6显示了MDA-MB-231-BM细胞比亲本MDA-MB-231细胞有更强的骨转移能力。 图7显示了MDA-MB-231-BM细胞比亲本MDA-MB-231细胞有更强的体内再生肿瘤能 力。