技术摘要：
本发明涉及花粉中玫瑰花粉、虞美人花粉、猕猴桃花粉和柳树花粉的单重和多重实时荧光PCR物种鉴别方法。本发明还涉及用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物，包含所述引物及探针的试剂盒，以及利用其检测花粉中上述植物成分的方法。使用本发明的组合物进行单重和多重实时 全部
背景技术：
蜂花粉种类繁多，既包括油菜、茶花、荷花、玫瑰等常规品种，也有猕猴桃、虞美人 等稀缺品种。蜂花粉营养价值十分丰富，包括碳水化合物、不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素、 微量元素、黄酮物质及其它生理活性物质，其中蜂花粉的抗氧化、预防前列腺和心血管疾病 等功效已经得到国内外科学家和医疗领域的认可。我国是世界上养蜂数量最多的国家，也 是蜂花粉生产及出口大国，蜂花粉作为一种优良的营养食品，及其产品市场高速增长。据统 计，我国蜂花粉年产量约4万吨，2015年出口蜂花粉2269吨，比2014年增长25%，在药品、食 品、保健食品、化妆品领域具有很大的商业价值。 随着社会的变化与科学技术的发展，蜂蜜作为一种优良的营养食品，人们越来越 关注蜂蜜的质量与安全。随之而来的是，蜂花粉的品种来源、质量优劣、掺假与否，营养价值 成为关注的焦点。而目前国内蜂花粉质量检测、活性成分分析和评价技术研究比较滞后，中 国药典2010年版标准一直沿用1995 年版质量标准，检验项目和检验方法未作任何的修订 与提升，食用安全性以及产业发展前景让人担忧。 实时荧光PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测，不仅可 以进行定性分析，还可以通过建立标准曲线对未知模板进行定量分析，广泛应用于食品真 伪鉴别的诸多领域。本研究以玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树花粉等不同植物来源蜂花粉为研 究目标，设计和筛选特异性引物探针，建立不同来源蜂花粉特异性检侧实时荧光PCR技术， 分析其特异性，绝对灵敏度，相对灵敏度等。以保证蜂花粉检测的特异性、覆盖度、准确性、 灵敏度。
技术实现要素：
本发明的目的在于高通量、简单、快速、特异且灵敏地检测蜂花粉及产品中的玫 瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分，能对蜂花粉及产品中的物种成分进行真伪鉴别，能有效防 止蜂花粉中掺杂非标识或廉价花粉。 本发明的发明人根据玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树的ITS基因，设计了能特异性检 测玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分的引物和探针，其中玫瑰序列为77 bp，虞美人靶序列为 65 bp左右，猕猴桃序列为185 bp，柳树序列为88 bp，片段均在200bp以内，目的片段较短， 保证能从不同加工程度的蜂花粉品中检测目标植物成分。 所 述 特 异 性 检 测 玫 瑰 成 分 的 寡 核 苷 酸 引 物 上 游 R o s e - F : 5’- 3 CN 111593134 A 说 明 书 2/5 页 GGAGGGTCTTGCGGCTCTG -3’（SEQ ID No.1），和下游Rose-R: 5’- CAAGCGCAAGCACCGAAA -3’ （SEQ ID No .2）。探针为Rose-P: 5’- CCTCATCCTAGGAGGCAAGTGTCTTGCGC -3’（SEQ ID No.3），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团QSY，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。检 测虞美人成分的寡核苷酸引物上游YMR-F: 5’- GGTGCGGTCGGTCTAAATACAGGC -3’（SEQ ID No.4），和下游YMR-R: 5’- CGAGTGTCGACCACCACGAATC -3’（SEQ ID No.5）。探针为YMR -P: 5’- CCTGGGAGGCCAGCGTCACGA -3’（SEQ ID No.6），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团 QSY，5’端连接有一个荧光报告基团ABY。检测猕猴桃成分的寡核苷酸引物上游MHT-F: 5’- TGACACTCTCATTCCCCGGT-3’（SEQ ID No.7），和下游MHT-R: 5’- TCGCATTTCGCTACGTTCTT-3’ （SEQ ID No.8）。探针为MHT-P: 5’- CAAGAATGCAACATCCATGCCCCG-3’（SEQ ID No.9），在探 针的3’端连接有一个荧光淬灭基团QSY，5’端连接有一个荧光报告基团VIC。检测柳树成分 的寡核苷酸引物上游Willow-F: 5’- GCCAAGGAAATTGAGTACTAGGAGC -3’（SEQ ID No.10）， 和下游Willow-R: 5’- CGAGAGCCGTTCAGATTATCACAA -3’（SEQ ID No.11）。探针为Willow- P: 5’- ACGCCCTCGTAGCCTCGGTGTCGGG -3’（SEQ ID No.12），在探针的3’端连接有一个荧光 淬灭基团QSY，5’端连接有一个荧光报告基团JUN。 在本发明的另一个方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的组合物。，所述组合物包 含选自以下（1）至（4）中的任意一组或多组引物和探针序列： （1）玫瑰特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1~SEQ ID No.2以及探针SEQ ID No.3 序 列； （2）虞美人特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No .4 和SEQ ID No .5 以及探针SEQ ID No.6 序列； （3）猕猴桃特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No .7 和SEQ ID No .8 以及探针SEQ ID No.9 序列； （4）柳树特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No .10 和SEQ ID No .8 以及探针SEQ ID No.12 序列。 在一个实施方案中，本发明提供了通过单重和多重实时荧光PCR方法快速检测花 粉中玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分的试剂盒。所述试剂盒包括本发明的用于多重和单重 实时荧光PCR方法检测玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分的特异性寡核苷酸引物特异性引物 对、探针、荧光PCR反应所需试剂和使用说明书。 优选的，所述单一实时荧光PCR反应体系为25 μL，包含12 .5 μL Taqman Gene Expression Master Mix，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10 μmol/L探针0.5 μL，模板DNA 5 μL（5 ng/μL），无菌ddH2O 6 μL。 多重实时荧光PCR反应，4种不同荧光的浓度为20 μmol/L的上游、下游引物和探针 分别按照1:1:1:1混合配置成Primer Mix和Probe Mix，对应的4种5 ng/μL花粉基因组DNA 等体积混合配置成DNA mix。总体积25 μL包含12.5 μL TaqMan Multiplex Master Mix，上 下游混合引物各1 μL，Probe Mix 1 μL，DNA mix 5 μL，无菌ddH2O 5 μL。 在一个实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于快速检测花粉中玫 瑰、虞美人、猕猴桃和柳树的单重和多重实时荧光PCR 扩增的条件的描述。所述试剂盒的说 明书中给出的玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树单重和多重实时荧光PCR扩增条件均为是50℃ 2 min；95℃预变性 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。优选地，本发明所使用单重和 4 CN 111593134 A 说 明 书 3/5 页 多重实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法。 在一个实施方案中，本发明的玫瑰树特异性引物分别根据玫瑰ITS序列设计。所述 试剂盒中包含玫瑰特异性扩增靶序列为: GGAGGGTCTTGCGGCTCTGCGCCCCCTCATCCTAGGAGGC AAGTGTCTTGCGCGTTGCATTTCGGTGCTTGCGCTTG (SEQ No.13)，在一个优选的实施方案中，所述 试剂盒的使用说明书中包括对用于单重和多重实时荧光PCR检测玫瑰特异性引物和扩增条 件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测玫瑰成分的试剂盒还包括对照品。 优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸 水。 在另一个实施方案中，本发明的虞美人特异性引物根据虞美人序列设计。所述试 剂盒中包含虞美人ITS基因特异性扩增靶序列为: GGTGCGGTCGGTCTAAATACAGGCCCTGGGAGG CCAGCGTCACGATTCGTGGTGGTCGACACTCG (SEQ No.14)，在一个优选的实施方案中，所述试剂 盒的使用说明书中包括对用于单重和多重实时荧光PCR检测虞美人特异性引物和扩增条件 的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测虞美人成分的试剂盒还包括对照品。 优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸 水。 在另一个实施方案中，本发明的猕猴桃特异性引物根据猕猴桃ITS基因序列设计。 所述试剂盒中包含松特异性扩增靶序列为: TGACACTCTCATTCCCCGGTCAAATAACGAACCCCGGC GCGAAATGCGTCAAGGAACTTGAACAAGAATGCAACATCCATGCCCCGTTTTTGGGTGCTTGTGGTGCTTGCTCTC TCATGAACGAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGA (SEQ No.15)，在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于单重和多重实 时荧光PCR检测猕猴桃特异性引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的 用于检测猕猴桃成分的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照 品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。 在另一个实施方案中，本发明的柳树特异性引物分别根据柳树ITS序列设计。所述 试剂盒中包含柳树特异性扩增靶序列为: GCCAAGGAAATTGAGTACTAGGAGCACGCCCTCGTAGCCT CGGTGTCGGGGGCGCGCCTTCTTTTTGTGATAATCTGAACGACTCTCG (SEQ No.16)，在一个优选的实施 方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于单重和多重实时荧光PCR检测柳树特异性 引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测柳树成分的试剂盒 还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对 照为无菌双蒸水。 在一个实施方案中，所述单重实时荧光PCR检测方法中玫瑰成分的绝对灵敏度最 低为10 pg/μL，虞美人成分的绝对灵敏度最低为0.01 pg /μL，猕猴桃成分的绝对灵敏度最 低为0.1 pg/μL，柳树成分的绝对灵敏度最低为1 pg/μL。 在一个实施方案中，多重实时荧光PCR检测玫瑰、虞美人、猕猴桃的绝对灵敏度最 低均为100 pg/μL，柳树的绝对灵敏度最低为10 pg/μL。 在一个实施方案中，所述单重实时荧光PCR检测方法的最低检出限为玫瑰1%，虞美 人、猕猴桃和柳树的最低检出限为0.1%。多重实时荧光PCR检测方法玫瑰的最低检出限为 0.5%，虞美人、猕猴桃和柳树的最低检出限为0.1%。 再在一方面，本发明提供了所述组合物或所述试剂盒在鉴别蜂花粉及其制品中玫 5 CN 111593134 A 说 明 书 4/5 页 瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分的应用。 本发明的通过引物或探针与模板的特异性杂交来鉴别模板的实时荧光PCR 检测 方法特异性高，假阳性低；多重实时荧光PCR提高了反应通量，缩短了反应时间。具有操作简 单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。使用本发明的单重和多重实时荧光PCR检测方 法，可用于国内外市场上蜂花粉及产品中玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分的定性检测。 附图说明 图1是利用单重实时荧光PCR检测猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞美人花粉引 物探针特异性时出现的典型的扩增曲线，检测样品分别为：猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花 粉、虞美人花粉、油菜花粉、荷花粉、茶花粉、松花粉、荞麦花粉、玉米、五味子、洋槐、党参、荆 条、月季、巨桉、椴树、紫云英、枣、西瓜、白芝麻、黑莓、板栗、杏仁、菊花、葵花、银杏、黄瓜、苹 果、梨、桃、橙、山楂、薰衣草、蚕豆，空白对照为无菌水，每个样品2个平行。 图2A是利用单重实时荧光PCR检测猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞美人花粉 引物探针绝对灵敏度时的扩增曲线，图2B是仪器自动生成的标准曲线，是利用单重实时荧 光PCR检测猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞美人花粉引物探针绝对灵敏度时仪器自动 生成的标准曲线，每个曲线下方的R2值、扩增效率、斜率默认仪器自动生成。检测的DNA浓度 梯度从100 ng/μL，10 ng/μL，1 ng/μL，0.1 ng/μL，0.01ng/μL，1 pg/μL，10 pg/μL到100 ng/μL，每个稀释度3个平行。 表1是使用单重实时荧光PCR方法检测猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞美人花 粉相对灵敏度检测结果分析，混合样品比例分别为0.1%，1%，10%，50%，90%，100% 每个稀释 度3个平行，方差用SD值表示。 图3是使用多重实时荧光PCR方法检测猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞美人花 粉特异性时出现的典型的扩增曲线。检测样品分别为：猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞 美人花粉、油菜花粉、荷花粉、茶花粉、松花粉、荞麦花粉、玉米、五味子、洋槐、党参、荆条、月 季、巨桉、椴树、紫云英、枣、西瓜、白芝麻、黑莓、板栗、杏仁、菊花、葵花、银杏、黄瓜、苹果、 梨、桃、橙、山楂、薰衣草、蚕豆，空白对照为无菌水，每个样品2个平行。 图4是利用多重实时荧光PCR检测猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞美人花粉引 物探针绝对灵敏度结果的标准曲线分析。DNA浓度梯度为100 ng/μL，10 ng/μL，1 ng/μL， 0.1 ng/μL，0.01ng/μL，1 pg/μL到10 pg/μL，每个稀释度2个平行。 表2是使用多重实时荧光PCR方法检测猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞美人花 粉最低检出限检测结果分析，混合样品比例分别为1%，0.5%，0.1%，每个稀释度3个平行，方 差用SD值表示。 6 CN 111593134 A 说 明 书 5/5 页
本发明涉及花粉中玫瑰花粉、虞美人花粉、猕猴桃花粉和柳树花粉的单重和多重实时荧光PCR物种鉴别方法。本发明还涉及用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物，包含所述引物及探针的试剂盒，以及利用其检测花粉中上述植物成分的方法。使用本发明的组合物进行单重和多重实时 全部
背景技术：
蜂花粉种类繁多，既包括油菜、茶花、荷花、玫瑰等常规品种，也有猕猴桃、虞美人 等稀缺品种。蜂花粉营养价值十分丰富，包括碳水化合物、不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素、 微量元素、黄酮物质及其它生理活性物质，其中蜂花粉的抗氧化、预防前列腺和心血管疾病 等功效已经得到国内外科学家和医疗领域的认可。我国是世界上养蜂数量最多的国家，也 是蜂花粉生产及出口大国，蜂花粉作为一种优良的营养食品，及其产品市场高速增长。据统 计，我国蜂花粉年产量约4万吨，2015年出口蜂花粉2269吨，比2014年增长25%，在药品、食 品、保健食品、化妆品领域具有很大的商业价值。 随着社会的变化与科学技术的发展，蜂蜜作为一种优良的营养食品，人们越来越 关注蜂蜜的质量与安全。随之而来的是，蜂花粉的品种来源、质量优劣、掺假与否，营养价值 成为关注的焦点。而目前国内蜂花粉质量检测、活性成分分析和评价技术研究比较滞后，中 国药典2010年版标准一直沿用1995 年版质量标准，检验项目和检验方法未作任何的修订 与提升，食用安全性以及产业发展前景让人担忧。 实时荧光PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测，不仅可 以进行定性分析，还可以通过建立标准曲线对未知模板进行定量分析，广泛应用于食品真 伪鉴别的诸多领域。本研究以玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树花粉等不同植物来源蜂花粉为研 究目标，设计和筛选特异性引物探针，建立不同来源蜂花粉特异性检侧实时荧光PCR技术， 分析其特异性，绝对灵敏度，相对灵敏度等。以保证蜂花粉检测的特异性、覆盖度、准确性、 灵敏度。
技术实现要素：
本发明的目的在于高通量、简单、快速、特异且灵敏地检测蜂花粉及产品中的玫 瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分，能对蜂花粉及产品中的物种成分进行真伪鉴别，能有效防 止蜂花粉中掺杂非标识或廉价花粉。 本发明的发明人根据玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树的ITS基因，设计了能特异性检 测玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分的引物和探针，其中玫瑰序列为77 bp，虞美人靶序列为 65 bp左右，猕猴桃序列为185 bp，柳树序列为88 bp，片段均在200bp以内，目的片段较短， 保证能从不同加工程度的蜂花粉品中检测目标植物成分。 所 述 特 异 性 检 测 玫 瑰 成 分 的 寡 核 苷 酸 引 物 上 游 R o s e - F : 5’- 3 CN 111593134 A 说 明 书 2/5 页 GGAGGGTCTTGCGGCTCTG -3’（SEQ ID No.1），和下游Rose-R: 5’- CAAGCGCAAGCACCGAAA -3’ （SEQ ID No .2）。探针为Rose-P: 5’- CCTCATCCTAGGAGGCAAGTGTCTTGCGC -3’（SEQ ID No.3），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团QSY，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。检 测虞美人成分的寡核苷酸引物上游YMR-F: 5’- GGTGCGGTCGGTCTAAATACAGGC -3’（SEQ ID No.4），和下游YMR-R: 5’- CGAGTGTCGACCACCACGAATC -3’（SEQ ID No.5）。探针为YMR -P: 5’- CCTGGGAGGCCAGCGTCACGA -3’（SEQ ID No.6），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团 QSY，5’端连接有一个荧光报告基团ABY。检测猕猴桃成分的寡核苷酸引物上游MHT-F: 5’- TGACACTCTCATTCCCCGGT-3’（SEQ ID No.7），和下游MHT-R: 5’- TCGCATTTCGCTACGTTCTT-3’ （SEQ ID No.8）。探针为MHT-P: 5’- CAAGAATGCAACATCCATGCCCCG-3’（SEQ ID No.9），在探 针的3’端连接有一个荧光淬灭基团QSY，5’端连接有一个荧光报告基团VIC。检测柳树成分 的寡核苷酸引物上游Willow-F: 5’- GCCAAGGAAATTGAGTACTAGGAGC -3’（SEQ ID No.10）， 和下游Willow-R: 5’- CGAGAGCCGTTCAGATTATCACAA -3’（SEQ ID No.11）。探针为Willow- P: 5’- ACGCCCTCGTAGCCTCGGTGTCGGG -3’（SEQ ID No.12），在探针的3’端连接有一个荧光 淬灭基团QSY，5’端连接有一个荧光报告基团JUN。 在本发明的另一个方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的组合物。，所述组合物包 含选自以下（1）至（4）中的任意一组或多组引物和探针序列： （1）玫瑰特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1~SEQ ID No.2以及探针SEQ ID No.3 序 列； （2）虞美人特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No .4 和SEQ ID No .5 以及探针SEQ ID No.6 序列； （3）猕猴桃特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No .7 和SEQ ID No .8 以及探针SEQ ID No.9 序列； （4）柳树特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No .10 和SEQ ID No .8 以及探针SEQ ID No.12 序列。 在一个实施方案中，本发明提供了通过单重和多重实时荧光PCR方法快速检测花 粉中玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分的试剂盒。所述试剂盒包括本发明的用于多重和单重 实时荧光PCR方法检测玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分的特异性寡核苷酸引物特异性引物 对、探针、荧光PCR反应所需试剂和使用说明书。 优选的，所述单一实时荧光PCR反应体系为25 μL，包含12 .5 μL Taqman Gene Expression Master Mix，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10 μmol/L探针0.5 μL，模板DNA 5 μL（5 ng/μL），无菌ddH2O 6 μL。 多重实时荧光PCR反应，4种不同荧光的浓度为20 μmol/L的上游、下游引物和探针 分别按照1:1:1:1混合配置成Primer Mix和Probe Mix，对应的4种5 ng/μL花粉基因组DNA 等体积混合配置成DNA mix。总体积25 μL包含12.5 μL TaqMan Multiplex Master Mix，上 下游混合引物各1 μL，Probe Mix 1 μL，DNA mix 5 μL，无菌ddH2O 5 μL。 在一个实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于快速检测花粉中玫 瑰、虞美人、猕猴桃和柳树的单重和多重实时荧光PCR 扩增的条件的描述。所述试剂盒的说 明书中给出的玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树单重和多重实时荧光PCR扩增条件均为是50℃ 2 min；95℃预变性 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。优选地，本发明所使用单重和 4 CN 111593134 A 说 明 书 3/5 页 多重实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法。 在一个实施方案中，本发明的玫瑰树特异性引物分别根据玫瑰ITS序列设计。所述 试剂盒中包含玫瑰特异性扩增靶序列为: GGAGGGTCTTGCGGCTCTGCGCCCCCTCATCCTAGGAGGC AAGTGTCTTGCGCGTTGCATTTCGGTGCTTGCGCTTG (SEQ No.13)，在一个优选的实施方案中，所述 试剂盒的使用说明书中包括对用于单重和多重实时荧光PCR检测玫瑰特异性引物和扩增条 件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测玫瑰成分的试剂盒还包括对照品。 优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸 水。 在另一个实施方案中，本发明的虞美人特异性引物根据虞美人序列设计。所述试 剂盒中包含虞美人ITS基因特异性扩增靶序列为: GGTGCGGTCGGTCTAAATACAGGCCCTGGGAGG CCAGCGTCACGATTCGTGGTGGTCGACACTCG (SEQ No.14)，在一个优选的实施方案中，所述试剂 盒的使用说明书中包括对用于单重和多重实时荧光PCR检测虞美人特异性引物和扩增条件 的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测虞美人成分的试剂盒还包括对照品。 优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸 水。 在另一个实施方案中，本发明的猕猴桃特异性引物根据猕猴桃ITS基因序列设计。 所述试剂盒中包含松特异性扩增靶序列为: TGACACTCTCATTCCCCGGTCAAATAACGAACCCCGGC GCGAAATGCGTCAAGGAACTTGAACAAGAATGCAACATCCATGCCCCGTTTTTGGGTGCTTGTGGTGCTTGCTCTC TCATGAACGAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGA (SEQ No.15)，在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于单重和多重实 时荧光PCR检测猕猴桃特异性引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的 用于检测猕猴桃成分的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照 品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。 在另一个实施方案中，本发明的柳树特异性引物分别根据柳树ITS序列设计。所述 试剂盒中包含柳树特异性扩增靶序列为: GCCAAGGAAATTGAGTACTAGGAGCACGCCCTCGTAGCCT CGGTGTCGGGGGCGCGCCTTCTTTTTGTGATAATCTGAACGACTCTCG (SEQ No.16)，在一个优选的实施 方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于单重和多重实时荧光PCR检测柳树特异性 引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测柳树成分的试剂盒 还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对 照为无菌双蒸水。 在一个实施方案中，所述单重实时荧光PCR检测方法中玫瑰成分的绝对灵敏度最 低为10 pg/μL，虞美人成分的绝对灵敏度最低为0.01 pg /μL，猕猴桃成分的绝对灵敏度最 低为0.1 pg/μL，柳树成分的绝对灵敏度最低为1 pg/μL。 在一个实施方案中，多重实时荧光PCR检测玫瑰、虞美人、猕猴桃的绝对灵敏度最 低均为100 pg/μL，柳树的绝对灵敏度最低为10 pg/μL。 在一个实施方案中，所述单重实时荧光PCR检测方法的最低检出限为玫瑰1%，虞美 人、猕猴桃和柳树的最低检出限为0.1%。多重实时荧光PCR检测方法玫瑰的最低检出限为 0.5%，虞美人、猕猴桃和柳树的最低检出限为0.1%。 再在一方面，本发明提供了所述组合物或所述试剂盒在鉴别蜂花粉及其制品中玫 5 CN 111593134 A 说 明 书 4/5 页 瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分的应用。 本发明的通过引物或探针与模板的特异性杂交来鉴别模板的实时荧光PCR 检测 方法特异性高，假阳性低；多重实时荧光PCR提高了反应通量，缩短了反应时间。具有操作简 单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。使用本发明的单重和多重实时荧光PCR检测方 法，可用于国内外市场上蜂花粉及产品中玫瑰、虞美人、猕猴桃和柳树成分的定性检测。 附图说明 图1是利用单重实时荧光PCR检测猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞美人花粉引 物探针特异性时出现的典型的扩增曲线，检测样品分别为：猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花 粉、虞美人花粉、油菜花粉、荷花粉、茶花粉、松花粉、荞麦花粉、玉米、五味子、洋槐、党参、荆 条、月季、巨桉、椴树、紫云英、枣、西瓜、白芝麻、黑莓、板栗、杏仁、菊花、葵花、银杏、黄瓜、苹 果、梨、桃、橙、山楂、薰衣草、蚕豆，空白对照为无菌水，每个样品2个平行。 图2A是利用单重实时荧光PCR检测猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞美人花粉 引物探针绝对灵敏度时的扩增曲线，图2B是仪器自动生成的标准曲线，是利用单重实时荧 光PCR检测猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞美人花粉引物探针绝对灵敏度时仪器自动 生成的标准曲线，每个曲线下方的R2值、扩增效率、斜率默认仪器自动生成。检测的DNA浓度 梯度从100 ng/μL，10 ng/μL，1 ng/μL，0.1 ng/μL，0.01ng/μL，1 pg/μL，10 pg/μL到100 ng/μL，每个稀释度3个平行。 表1是使用单重实时荧光PCR方法检测猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞美人花 粉相对灵敏度检测结果分析，混合样品比例分别为0.1%，1%，10%，50%，90%，100% 每个稀释 度3个平行，方差用SD值表示。 图3是使用多重实时荧光PCR方法检测猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞美人花 粉特异性时出现的典型的扩增曲线。检测样品分别为：猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞 美人花粉、油菜花粉、荷花粉、茶花粉、松花粉、荞麦花粉、玉米、五味子、洋槐、党参、荆条、月 季、巨桉、椴树、紫云英、枣、西瓜、白芝麻、黑莓、板栗、杏仁、菊花、葵花、银杏、黄瓜、苹果、 梨、桃、橙、山楂、薰衣草、蚕豆，空白对照为无菌水，每个样品2个平行。 图4是利用多重实时荧光PCR检测猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞美人花粉引 物探针绝对灵敏度结果的标准曲线分析。DNA浓度梯度为100 ng/μL，10 ng/μL，1 ng/μL， 0.1 ng/μL，0.01ng/μL，1 pg/μL到10 pg/μL，每个稀释度2个平行。 表2是使用多重实时荧光PCR方法检测猕猴桃花粉、柳树花粉、玫瑰花粉、虞美人花 粉最低检出限检测结果分析，混合样品比例分别为1%，0.5%，0.1%，每个稀释度3个平行，方 差用SD值表示。 6 CN 111593134 A 说 明 书 5/5 页
