技术摘要：
本发明涉及生物与医学检测技术领域，提供了一种肝细胞癌血清中CTC的分离捕获方法，包括如下步骤：采集血样并处理；洗涤结合了GPC3抗体的磁微粒；抗体孵育：将结合了GPC3抗体的磁微粒缓慢加入到处理好的血样本中，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上；分离捕获CT  全部
背景技术：
肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)是肝癌的主要组织学亚型，占原发性 肝癌的90％，HCC的发病率约为每年10.1例/10万人，每年因HCC而死亡的病例超过60万例， 是目前世界第六大恶性肿瘤，在肿瘤死因中排名第二，尤其是在亚洲、非洲和南部欧洲。流 行病学统计调查显示，在亚洲地区的HCC与乙肝病毒感染具有密切联系。此外，丙肝病毒、肝 硬化、过度酗酒以及黄曲霉素的摄入都是HCC的高危因素。HCC的发生是一个多阶段、多因素 的协同作用，经过启动、促癌和演进等过程以及多个癌基因和相关基因参与的结果。由于 HCC潜伏期长、增殖极为迅速，使得早期的诊断和治疗受到了极大的限制。 近年来，随着一些肝癌生物学标志物的发现，使得人类对肝癌发生、发展的认识有 了长足的进步，磷脂酰基醇蛋白多糖-3(Glypican-3，GPC3)是Glypican家族的一员，属膜性 (membranous)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Heparan  sulfateproteoglycan，HSPG)，在脊椎动物 中有6个成员，基本结构相似，包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素(HS)链和糖基化磷脂酰基醇 (GPI)。人类GPC3基因最早于1996年被克隆，与果蝇的Dally基因有同源性，由8个外显子组 成。在哺乳动物的胚胎期，GPC3通过影响多个分子信号通路而对组织器官的发育起重要调 控作用，其功能缺失将导致多度生长和畸变综合征(SGBS)。成人GPC3的异常表达与多种肿 瘤的发生发展关系密切。在乳腺癌和卵巢癌中为表达缺失，在肾癌、肺鳞癌、甲状腺癌、梅克 尔细胞癌、胃癌、大肠癌等呈现过表达。有研究发现，用正常肝细胞进行体外实验，发现GPC3 蛋白和mRNA表达同时达到高峰时，细胞分裂增殖开始下降，揭示其负性调节肝细胞生长；在 肝细胞癌早期，GPC3呈现高表达，并被学者研究证实GPC3具有对HCC进行早期检测的价值。 本发明采用GPC3抗体结合免疫磁珠捕获GPC3阳性的CTC，提高分选效率，结合DNA 的分析方法，提高对HCC的检测效果。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种肝细胞癌血清中CTC的分离捕获及检测方法，采用GPC3 抗体结合免疫磁珠捕获GPC3阳性的CTC，提高分选效率，结合获悉释放的DNA携带的遗传信 息的蛛丝马迹并加以检测分析，实现利用无创的液体活检方式及时检测DNA的分析方法。 本发明采用的技术方案如下：一种肝细胞癌血清中CTC的分离捕获方法，包括如下 步骤： (1)采集血样：取来自肝细胞癌患者的外周血置于抗凝离心管中并混匀全血标本； (2)对血样进行前置处理：对步骤(1)中的血样依次进行去除血浆蛋白及血浆核 酸、去除红细胞、分层离心、去除白细胞的处理； (3)洗涤磁微粒：吸取适量结合了GPC3抗体的磁微粒混悬液至EP管中，静置后吸弃 4 CN 111593024 A 说　明　书 2/5 页 溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清，重复3次后用缓冲液重悬GPC3磁微粒至原体积； (4)抗体孵育：将结合了GPC3抗体的磁微粒缓慢加入步骤(2)中处理好的血样本 中，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动30min，每10min混匀一次； (5)分离捕获CTC：将步骤(4)中的液体转移至一支新的抗凝离心管中，靠于磁力架 上，捕获CTC的磁珠会吸附在磁力架一侧，倒置磁力架和抗凝离心管，洗下离心管盖上的样 本； (6)静置10分钟后，吸弃澄清液，随后加1mL  dd  H2O清洗磁球； (7)加100uLCF1进行涂片，在37℃条件下烘干； (8)滴加4％多聚甲醛固定8min，在装有2×SSC的37℃的水浴锅中预热10min； (9)分别选用75％、85％和无水乙醇进行脱水，分别进行2min，并在室温下风干； (10)加10uL荧光探针并封片，置于杂交仪中76℃杂交10min，37℃杂交1.5h； (11)用镊子撕去封片胶，放入43℃的甲酰胺中，脱落盖玻片，浸洗10min，再采用2 ×SSC浸洗15min，并每5min摇晃一次； (12)在样本区涂100uL的CK荧光抗体染色液，37℃湿盒避光条件下孵育1h； (13)洗弃CK荧光抗体染色液，用0.2％BSA洗两次后，加10uL  DAPI盖片读片。 优选的，所述步骤(4)中，具体为取10uL结合了GPC3抗体的磁微粒至于7.5mL的样 品中混匀。 优选的，所述步骤(2)中血样前置处理的具体步骤为： S1：去除血浆蛋白及血浆核酸：将采集的血样中加入缓冲液，离心去上清液，轻摇 抗凝离心管混匀沉淀细胞； S2：去除红细胞：将上述混匀的抗凝离心管中加入裂解液，将抗凝离心管置于垂直 混匀仪混匀，离心弃上清液，轻摇抗凝离心管混匀沉淀细胞后补加缓冲液； S3：分层离心：于一支新的抗凝离心管中加入分层液，将S2中的所有液体叠加到分 层液顶层，然后用缓冲液清洗S2中的抗凝离心管管壁，并将清洗液同时转移至缓冲液顶层 离心； S4：去除白细胞：S3中的抗凝离心管离心后可见三层溶液，轻柔吸取最上两层溶液 于一支新的离心管内，分别加缓冲液，颠倒混匀后离心弃上清液，加入缓冲液，混匀沉淀细 胞。 优选的，所述结合了GPC3抗体的磁微粒由氧化铁Fe3O4纳米颗粒、Cholesterol、 GHDC、DOPC、GPC3组成。 一种肝细胞癌血清中CTC的检测方法，采用QIAGEN试剂盒进行基于循环肿瘤细胞 的DNA提取的方法，具体步骤如下： (a)取10ml步骤(2)中处理后的血样并加入2.5倍体积的SolutionA，颠倒混匀，在 8000rpm下离心5分钟后弃掉上清液，并重复1-2次上述步骤； (b)按照QIAGEN试剂盒附表提供的信息配制Solution  B与Solution  C的混合液； (c)加入5ml  Solution  B与Solution  C的混合液，用一次性塑料吸管吹打均匀，60 ℃的水浴或孵箱中孵育10分钟，孵育期间颠倒混匀一次，溶液由红色变为黄绿色或棕色； (d)加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀至出现丝状或絮状DNA； (e)用移液器将絮状物移到加有800μL、75％酒精的1.5ml  EP管中，颠倒数次，然后 5 CN 111593024 A 说　明　书 3/5 页 在12000prm下离心1分钟，弃掉上清液，室温下干燥10～15分钟； (f)加入1000μL  Elutionbuffer，60℃孵育10～15分钟或过夜溶解DNA，用移液器 或一次性塑料吸管吹打均匀，-20℃保存DNA； (g)采用高通量测序法进行胆道肿瘤血液循环肿瘤细胞来源的DNA突变检测。 本发明的优点在于：采用GPC3抗体结合免疫磁珠捕获GPC3阳性的CTC，提高分选效 率，结合获悉释放的DNA携带的遗传信息的蛛丝马迹并加以检测分析，实现利用无创的液体 活检方式及时检测DNA的分析方法。 附图说明 图1为本发明中结合了GPC3抗体的磁微粒制备流程图。 图2为本发明中经免疫磁性脂质体分离的外周血CTC的免疫荧光图。