技术摘要：
本发明公开了联产1,3‑丙二醇和D‑1,2,4‑丁三醇的方法，属于发酵技术领域以及生物技术领域。本发明提供了一种可高效转化甘油和木糖联产1,3‑丙二醇和D‑1,2,4‑丁三醇的重组克雷伯氏菌，此重组克雷伯氏菌以克雷伯氏菌为宿主，表达编码木糖脱氢酶的基因xdh、编码2‑酮  全部
背景技术：
1,3-丙二醇(1,3-propanediol，1,3-PDO)为无色、无臭，具有咸味和吸湿性的黏稠 液体。在聚氨酯行业中，它常用作聚酯多元醇的原料、聚醚多元醇的起始剂和聚氨酯的扩链 剂等；在有机化工行业中，它是重要的单体和中间体，最主要的用途是作为聚合物单体合成 聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)。因此，1,3-丙二醇的市场容量巨大。 目前，工业上常通过将可生产1 ,3-丙二醇的肺炎克雷伯菌(Klebsiella  Pneumoniae)接种至含有甘油的发酵培养基中进行发酵以生产1,3-丙二醇。但是，肺炎克雷 伯菌以甘油作为碳源生产1,3-丙二醇时还原力不足，这直接导致了甘油的转化率低下以及 1,3-丙二醇的产量低下(具体可见参考文献：付晓萌.利用木糖途径对克雷伯氏菌合成1,3- 丙二醇代谢中NAD(P)H-NAD(P)的研究[D].[硕士学位论文].无锡:江南大学生物工程学院, 2015.)。 研究表明，木糖的加入可有效增加肺炎克雷伯菌以甘油作为碳源生产1,3-丙二醇 时的还原力，进而提高肺炎克雷伯菌以甘油作为碳源生产1,3-丙二醇时的甘油转化率和1, 3-丙二醇产量(具体可见参考文献：陈琳,王领民,金平,等.甘油和木糖共发酵生产1,3-丙 二醇的研究[J].化学工程,2013,41(07):5-8.)。但是，木糖的价格偏高，并且，木糖在1,3- 丙二醇生产过程中的转化率低下，这严重限制了木糖在1,3-丙二醇生产中的应用。 因此，急需找到一种提高木糖在1,3-丙二醇生产过程中的转化率的方法。
技术实现要素：
[技术问题] 本发明要解决的技术问题是提供一种木糖转化率高的生产1,3-丙二醇的方法。 [技术方案] 为解决本发明的技术问题，本发明提供了一种重组克雷伯氏菌，所述重组克雷伯 氏菌以克雷伯氏菌(Klebsiella)为宿主，表达编码木糖脱氢酶的基因xdh、编码2-酮异戊酸 脱羧酶的基因kivD以及编码木糖酸脱水酶的基因yjhG。 在本发明的一种实施方式中，所述克雷伯氏菌为肺炎克雷伯菌(Klebsiella  Pneumoniae)。 在本发明的一种实施方式中，所述木糖脱氢酶来源于新月柄杆菌(Caulobacter  crescentus)。 在本发明的一种实施方式中，所述木糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ  ID  No.1所示。 在本发明的一种实施方式中，所述编码木糖脱氢酶的基因xdh的核苷酸序列如SEQ  ID  No.2所示。 3 CN 111593014 A 说　明　书 2/5 页 在本发明的一种实施方式中，所述2-酮异戊酸脱羧酶来源于乳酸乳球菌 (Lactococcus  lactis)。 在本发明的一种实施方式中，所述2-酮异戊酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ  ID  No.3所示。 在本发明的一种实施方式中，所述编码2-酮异戊酸脱羧酶的基因kivD的核苷酸序 列如SEQ  ID  No.4所示。 在本发明的一种实施方式中，所述木糖酸脱水酶来源于大肠杆菌(Escherichia  coli)。 在本发明的一种实施方式中，所述木糖酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ  ID  No.5所 示。 在本发明的一种实施方式中，所述编码木糖酸脱水酶的基因yjhG的核苷酸序列如 SEQ  ID  No.6所示。 在本发明的一种实施方式中，所述重组克雷伯氏菌以克雷伯氏菌(Klebsiella)为 宿主，以pEtac质粒为表达载体，表达编码木糖脱氢酶的基因xdh、编码2-酮异戊酸脱羧酶的 基因kivD以及编码木糖酸脱水酶的基因yjhG。 本发明还提供了一种联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的方法，所述方法为先将 上述重组克雷伯氏菌接种至含有甘油和木糖的发酵培养基中进行发酵，获得发酵液，然后 将发酵液进行提取，获得1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇。 在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为35～40℃。 在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为37℃。 在本发明的一种实施方式中，所述发酵的转速为170～200rpm。 在本发明的一种实施方式中，所述发酵的转速为180rpm。 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖10g/L、木糖30g/ L、甘油20g/L、酵母粉7.5g/L、氯化钠15g/L、蛋白胨15g/L、MgSO4  2g/L、(NH4)2SO4  2g/L、 KH2PO4  7.5g/L、FeSO4·7H2O  0.005g/L、VB12  5g/L以及微量元素溶液100μL/L；所述微量元 素溶液的成分包含ZnCl2  0 .7g/L、MnCL2·4H2O  1g/L、H3BO3  0 .6g/L、CoCL2·6H2O  2g/L、 CuCL20.2g/L、NiCL2·6H2O  0.25g/L以及Na2MoO4·2H2O  0.35g/L。 本发明还提供了上述重组克雷伯氏菌或上述方法在生产1,3-丙二醇和D-1 ,2,4- 丁三醇方面的应用。 [有益效果] (1)本发明提供了一种可高效转化甘油和木糖联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇 的重组克雷伯氏菌，此重组克雷伯氏菌以克雷伯氏菌为宿主，表达编码木糖脱氢酶的基因 xdh、编码2-酮异戊酸脱羧酶的基因kivD以及编码木糖酸脱水酶的基因yjhG；将此重组克雷 伯氏菌接种至含有甘油和木糖的发酵培养基中发酵48h，即可使发酵液中1,3-丙二醇的产 量高达18.1g/L、D-1 ,2 ,4-丁三醇的产量高达3.3g/L，此时，发酵液中甘油的转化率高达 45.3％、木糖的转化率高达12.3％。 (2)本发明提供了一种高效转化甘油和木糖联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的 方法，此方法为将表达编码木糖脱氢酶的基因xdh、编码2-酮异戊酸脱羧酶的基因kivD以及 编码木糖酸脱水酶的基因yjhG的重组克雷伯氏菌接种至含有甘油和木糖的发酵培养基中 4 CN 111593014 A 说　明　书 3/5 页 进行发酵；利用此方法发酵48h，即可使发酵液中1,3-丙二醇的产量高达18.1g/L、D-1,2,4- 丁三醇的产量高达3.3g/L，此时，发酵液中甘油的转化率高达45.3％、木糖的转化率高达 12.3％；并且，由于D-1,2,4-丁三醇价值较高，利用此方法转化甘油和木糖联产1,3-丙二醇 和D-1,2,4-丁三醇的价效高达12.31元/L，远高于单独合成1,3-丙二醇，利润较高。 附图说明 图1：重组质粒pEtac-yjhG-tac-kivD-tac-xdh的酶切酶切验证结果；其中，M： 2503DNA  marker；1：XbaⅠ单酶切产物；2：XbaⅠ和NcoⅠ双酶切产物。 图2：重组质粒pEtac-yjhG-tac-kivD-tac-xdh的质粒图谱。 图3：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中生物量的变化。 图4：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中甘油和1,3-丙二醇含量的变化。 图5：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中木糖和D-1,2,4-丁三醇含量的变化。 图6：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中2,3-丁二醇含量的变化。 图7：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中琥珀酸含量的变化。 图8：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中乳酸含量的变化。 图9：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中乙酸含量的变化。 图10：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中乙醇含量的变化。